frysförvaring rutiner är de som tillåter cellerna att lagras på obestämd tid genom att använda extrem kyla för att avbryta metaboliska aktiviteter. Det finns två huvudtyper av frysförvaring förfaranden: jämvikt (konventionell långsam frysning) och icke-jämvikt eller ultra-snabb nedfrysning (vitrification). Termen förglasningen kommer från latinets "glaskroppen" eller glasartad. Båda förfarandena använder kryoskyddsmedel med frostskyddsmedel-typ egenskaper för att förebygga cellskador under frysningen. När cellerna fryses eller keramiskt, kan de lagras på obestämd tid genom att sänka ner dem i flytande kväve, en extremt kall vätska med en temperatur på -196 C (-321 F). För att återställa metaboliska aktiviteten i cellen vid upptining, måste giftiga kryoskyddsmedel avlägsnas från cellen och den normala vattenbalansen successivt återställas när cellen återgår till en normal fungerande temperatur.
Cell- specifika faktorer
Det förfarande som används för att cryopreserve celler eller vävnad beror på ett antal faktorer innefattande storleken av cellen, mängden cellulär vätska (cytoplasma) och komplexiteten hos cellen (enstaka cell eller vävnad). Celler med en stor mängd cytoplasman såsom ägg är svårare att cryopreserve än celler med endast kvarvarande cytoplasma, som spermier. Kryokonservering av äggstocksvävnad är mer utmanande eftersom åtminstone tre olika celltyper av varierande storlek är närvarande i äggstocksvävnad, var och en med olika optimala frysning behov. Långsam-frysning protokoll har använts med framgång med olika typer av celler. Förglasning är för närvarande mest effektiva med encelliga frysning och mindre effektiv med vävnader, men forskning pågår för att optimera vitrifiering av vävnader.
Roll Kryoskyddande medel
cytoplasma en cell innehåller vatten, vilket blir till iskristaller vid frysning temperatur. När is bildas inuti en cell, är cellen strimlas och dör. Därför måste fluiden i cellen som skall avlägsnas innan det har nått frystemperaturer att undvika cellskador. Olika typer av frostskyddsmedel (kryoskyddsmedel) fluider kan användas för att dehydratisera cellen före frysning, inklusive glycerol, propandiol, dimetyl sulfoxde (DMSO), etanol och socker såsom sackaros och trehalos. Den optimala hastigheten för kylning (och upptining) beror på den använda typen av kryoskyddande medel och på karakteristiska av cellen eller vävnaden att vara (eller det var) fryst. Kryoskyddsmedel är giftiga för metaboliserande celler så cell exponeringar mot kryoskyddsmedel vid varmare metaboliska temperaturer måste minimeras eller undvikas. Efter upptining eller uppvärmning av cellerna, måste cryoprotectants tas bort helt från cellen innan metabolisk aktivitet återställs. Graden av frysning
Equilibrium kontra icke-Equilibrium Cryopreservation Procedure
beror på huruvida den frysning protokollet är jämvikt-eller icke-jämvikten-baserade. Procedurer jämvikt typ, är den optimala fryshastighet uppnås när det finns en balans mellan den hastighet med vilken cellen bli uttorkad av vatten och den hastighet med vilken vatten utanför cellen håller på att omvandlas till isen scenen. Dessa jämvikt eller långsamt frysa protokoll brukar ta timmar att slutföra och en dator används för att driva en programmerbar hastighet frys för att se till att frysa priserna är exakt som krävs. Det är vanligtvis en "hold" steg i protokollet nära starten så att den manuella skapandet av förrätt iskristaller eller "seeding" i vätskan utanför cellerna.
Vitrifiering, ett helt annat förhållningssätt till frysning som inte förlitar sig på ramper och uppnå en jämvikt mellan uttorkning och iskristallbildning används. Förglasning är så extremt snabb att det finns tillräckligt med tid för isbildning och cellulära vätskan omvandlas direkt till en glasartad eller glas fas, utan att skada cellen. Programmerbara rate frysar krävs inte eftersom cellen är direkt nedsänkt i extremt kalla flytande kväve, att uppnå en momentan glasartat tillstånd.
Slow-Freeze Förfarande
Det första steget i den långsamma-freeze förfarande är att exponera cellen att kryoskyddande i en successiv stegvis sätt att långsamt tillåta ekvilibrering av cellen med det kryoskyddande medlet medan släppa vatten. När cellerna har rensats för majoriteten av cellulär vatten är cellerna i det kryoskyddande medlet vätska placeras i en behållare av något slag, såsom en plast halm, en glasampull eller en plast vial.The vätskevolym som omger cellerna för långsam frysning är vanligen mindre än en tesked och kan bara vara några droppar. För-märkta behållare är fylld, förseglades och placerades i en programmerbar frys, som långsamt sänker temperaturen hos behållaren under en period av minuter eller timmar till mycket låga temperaturer. Efter ett par minuter av kylning måste starter iskristaller bildas inuti behållaren med "ympning" behållaren. Sådd utförs med hjälp av ett verktyg (t.ex. tång) som har pre-kyld i flytande kväve för att röra behållaren och orsaka iskristallbildning. Denna starter kristall kommer att initiera kontrollerad iskristallbildning på ett ställe, på ett säkert avstånd från cellerna. När sådd är klar, kan resten av kylning ramper vidare. När behållaren når temperaturer mellan -30 och -85 C, kan behållaren som innehåller cellerna doppas direkt i flytande kväve för att slutföra kylning till -196 C.
Förglasning
Ultra-snabb icke-jämvikt kylning förfaranden såsom vitrifikation använda högre koncentrationer av kryoskyddsmedlen kombination med en nästan ögonblicklig frysning som uppnåtts genom störta celler direkt i flytande kväve. Förglasning förbi isen-kristallbildningen fas och flyttar vatten direkt i en glasliknande fas. Förglasning uppnår samma slutpunkt som långsam frysning, men med en hastighet av -3000C/min, jämfört med 10C/min eller mer. För förglasning, celler vanligtvis placeras på spetsen av ett sugrör och överskott av kryoskyddande avlägsnas och lämnar bara tillräckligt så att cellen håller fast vid behållaren genom ytspänning, före störta i flytande kväve. Eftersom frysning är så snabb, är varaktigheten av exponering för cryoprotectants mycket mindre, och mycket högre koncentrationer av kryoskyddsmedlen kan tolereras av cellen. Uppvärmningen av cellen för att återgå till normal metabolisk funktion måste också vara oerhört snabb. Hantering av keramiska prover är mycket mer krävande än långsamt frysta prover eftersom även en kort exponering för en temperatur över den för flytande kväve kan starta en oplanerad uppvärmningen och refreezing, vilket är skadligt för cellen.
Upphovsrätt © Liv och hälsa