Hur man använder GSH i att upptäcka ROS

Glutation, eller GSH är en icke-essentiell tripeptid gjord av cystein, glutamat och glycin. Det är en kraftfull antioxidant som skyddar celler och organ i kroppen från de skadliga effekterna av ROS, eller reaktiva syreföreningar, som bildas från molekylärt syre som en följd av olika metaboliska processer i kroppen. Antioxidanter, såsom glutation, neutralisera ROS och hindra dem från att interagera med och skada DNA och protein i dina celler. Förhållandet av oxiderad och reducerad form av GSH i kroppen är indikativ för ROS-relaterade oxidativ stress i kroppen. Saker du behöver
Spruta
fjäril nål
Centrifug
Natriumheparin
Frys
sulfonsalicylsyra
GSH Reaction Agent
Microplate
Ljuskälla GSH standardlösning
Visa Fler Instruktioner
en

Draw ca 2 ml blod genom venpunktion till anticubetal venen med en 23-gauge fjärilsnål fäst till en 5 ml spruta. Lägg provet till provrör innehållande natrium heparin och försiktigt vända röret för blandning.
2

Samla de röda blodkropparna genom centrifugering av provet vid 2500 varv per minut i fem minuter. Frysa och tina provet tre gånger för att bryta cellerna. Centrifugera lösningen cellysatet under 10 minuter vid 12.000 rpm och 4 grader, och samla in supernatanten.
3

bort protein från provet genom att lägga till 5 procent sulfonsalicylsyra och centrifugering av provet vid 12.000 rpm under fem minuter vid 4 grader. Förvara deproteinerades supernatanten vid -112 grader.
4

Blanda en tiol detektionsmedel, GSH-reduktas, nikotinamidadenindinukleotidfosfat och analysbuffert i proportioner som anges av satsen tillverkaren att göra GSH reaktionsblandningen. Mängden av varje kemikalie beror på antalet tester du tänker utföra. Späd GSH reaktionsblandningen i 5 procent sulfosalicylsyra att få koncentrationer av 16, 32, 63, 125, 250 och 500 mikroliter.
5

Lägg 1-10 mikroliter av deproteinerades blodprovet i brunnarna av en mikroplatta. Lägg serieutspädd GSH standardlösning, som är tillgänglig i test kit, till varje brunn för att få den totala volymen av varje brunn till 10 mikroliter.
6

Lägg 90 mikroliter GSH reaktionsblandning som du gjort i steg 4 till varje brunn i mikroplattan. Blanda reagenset genom skakning av plattan i 30 sekunder.
7

Mät absorbansen omedelbart genom att placera plattan under ljus med våglängder av 405 och 415 nanometer. Inkubera plattan i 30 minuter. Ta absorbansavläsningar efter var femte minut under inkubationstiden.
8

Späd 6 millimol av bearbetat prov med 5 procent sulfonsalicylsyra och trifluromethane sulfonate lösning. Detta kommer att ta bort all den reducerade GSH från lösningen. Lägg 1-10 micoliters av denna lösning till brunnarna i mikroplattan och upprepa steg 5, 6 och 7. Detta kommer att hjälpa uppskatta mängden oxiderat GSH i provet.
9

Plot absorbans och koncentration prov på en graf för att få GSH kurvan för både reducerat och oxiderat glutation. Beräkna förhållandet mellan de båda formerna av GSH. Ökade nivåer oxidativa GSH indikerar oxidativ stress och ROS.