Molekylär kloning Protokoll

molekylär kloning protokoll omfattar de förfaranden som används för att definiera, isolering och replikera en DNA-sekvens. Traditionell restriktion och ligering protokoll kloning initiera DNA-fragmentering med begränsade endonukleaser (enzymer som skär DNA-strängar vid restriktionsställen), DNA-fragment ligering (reparation av diskontinuiteter i DNA-molekyler), transfektion (införandet av nukleinsyra i en cell kropp) och urval (det val av individuella genomen för replikering). Isolering

Protokoll för isolering av ett DNA-fragment, det första steget i molekylär kloning, omfattar ofta en polymeraskedjereaktion (PMR), som använder cykler av uppvärmning och kylning för att amplifiera delar av DNA. För att nå den storlek målet sekvens, andra protokoll inkluderar DNA ultraljudsbehandling, reaktion enzymet matsmältning och användning av kemiskt syntetiserade oligonukleotider. Dessa protokoll variera beroende på storlek och mängd som behövs av isolerat DNA.
Ligation

Protokoll för ligering involverar användning av ett enzym, DNA-ligas, för att gå DNA-molekyler tillsammans med en kovalent bindning. Protokoll dikterar kombinera DNA-fragment, kloningsvektom, en ligationsbuffert, DNA-ligas och steriliserat vatten i ett mikrocentrifugrör och inkubera över natten vid 4 grader Celsius.
Transfection

Protokoll för transfektion, eller infusion DNA i en cell med en icke-virala medel, ofta innebär en injektion av DNA direkt in i cellens cytoplasma. Andra metoder inkluderar användning av kemiska reagens, såsom kalciumfosfat och lipider, för att leverera den transfektion komplex genom cellmembranet. Denna metod testar effekterna av genmodifiering om hur specifika gener.
Selection

Selection, eller screening, protokoll avgöra vilka celler som framgångsrikt hållit DNA insatsen och ange vilka celler behöver isolering. En centrifug skördar celler som innehåller det transfekterade DNA: t, som sedan inkuberas i en lysozym (ett naturligt förekommande enzym)-buffert och behandlades med en alkalisk detergent, som ger de proteiner och membraner löslighet. Använda acetat för utfällning av proteiner, en centrifug och cheesecloth filter DNA-innehållande supernatanten (den lösliga vätskan kvar från ett centrifugerat förening). Supernatanten utfälldes med polyetylenglykol, centrifugerades, och suspenderades i en cesiumklorid och etidiumbromid buffert. Etidiumbromiden fläckar DNA enligt densitet, och med användning av en långvågig UV-ljus, är med lägre band DNA extraherat med en fem cc spruta. En jämviktad jonbytarkolonn separerar DNA från etidiumbromid och cesiumklorid, och den slutliga DNA-pelleten suspenderas i en buffertlösning och detekteras på agarosgelelektrofores.