Western blot-analys är en välkänd och etablerad teknik för att identifiera specifika proteiner som isolerats från vävnad. Proteinerna separeras först efter laddning och molekylvikt på en SDS-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) och överförs därefter till ett nitrocellulosamembran. Efter överföringen binder märkta antikroppar specifikt till det önskade proteinet, som sedan fotograferas med röntgenfilm eller visualiseras med en proteinspecifik färgning. Det slutliga resultatet visas som mörka band, vilka indikerar närvaron av det identifierade proteinet.
Den här artikeln beskriver den grundläggande metoden för att utföra en Western blot-analys i ett laboratorium som är kvalificerat för komplex proteinforskning.
Det här behöver du
- SDS-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) med separerade proteiner
- Nitrocellulosamembran
- Destillerat vatten
- Överföringsbuffert (30 g Tris, 144 g glycin och 200 ml metanol i 1 liter vatten)
- Filterpapper, Whatman 3 mm
- Laboratoriesvamp
- Överföringskammare för Western blot
- Laboratorienätaggregat
- Laboratoriekylskåp
- Laboratorieskakare (rotator)
- Trisbuffrerad saltlösning (TBS) (24,2 g Tris-bas och 80 g NaCl i 1 liter vatten)
- Blockeringslösning (5 procent fettfritt mjölkpulver i TBS)
- Primär antikroppslösning
- Märkt antikroppskonjugatlösning
- Substratlösning för alkaliskt fosfatas med färgämnet nitroblått tetrazolium
- Fosfatbuffrerad saltlösning (PBS)
- Gelavbildare (gel-imager)
Instruktioner
Överföra proteiner till nitrocellulosamembranet
- Förbered nitrocellulosamembranet. Blötlägg membranet i destillerat vatten i två minuter och placera det därefter i överföringsbufferten, där det får ligga i fem minuter.
- Bygg upp en överföringssandwich. Konstruktionen består av svamp/filterpapper/SDS-PAGE-gel/nitrocellulosamembran/filterpapper/svamp. Sandwichen placeras så att membranet ligger närmast anoden och gelen närmast katoden inne i överföringskammaren.
- Tillsätt överföringsbuffert i kammaren så att sandwichen blir helt nedsänkt. Placera kammaren i laboratoriekylskåpet – överföringen av protein från gelen till membranet ska alltid utföras vid 4 grader Celsius.
- Anslut och ställ in nätaggregatet för att överföra proteinerna från gelen till membranet. Överföringsriktningen går mot anoden, vilket markeras av den röda ledningen. Större proteiner rör sig snabbare i det elektriska fältet och vandrar först. Nätaggregatet styr överföringshastigheten; ställ in 30 V och 40 mA för en överföring över natten.
- Koppla bort nätaggregatet när överföringen är klar. Rör aldrig vid överföringsbufferten eller ta ur sandwichen medan nätaggregatet fortfarande är anslutet.
- Ta bort membranet från sandwichen och inkubera det i två timmar i blockeringslösning. Proteinerna i blockeringslösningen absorberas i membranet på de ställen där inga målproteiner finns, vilket förhindrar att antikroppar binder fast där det önskade proteinet inte finns.
Binda antikroppen
- Inkubera membranet med primär antikroppslösning på laboratorieskakaren. Membranet måste vara helt nedsänkt i lösningen i minst en timme; det är också fullt acceptabelt att låta inkubationen pågå över natten.
- Tvätta membranet noggrant för att avlägsna obunden antikropp. Fyra separata tvättar à 10 minuter i TBS räcker vanligtvis för att få bort överskottet av antikropp.
- Inkubera membranet i märkt antikroppskonjugatlösning på skakaren i minst en timme. Den märkta konjugaten är kopplad till enzymet alkaliskt fosfatas – det är denna enzym-antikroppsblandning som känner igen och binder till den primära antikroppen.
Detektera proteinet
- Skölj membranet i PBS i 10 minuter, upprepa totalt fyra gånger. Detta avlägsnar resterna av den märkta antikroppskonjugaten.
- Inkubera membranet i substratlösning för alkaliskt fosfatas tills bandmönstret framträder. Färgämnet i substratlösningen binder till antikropp–antigen–proteinkomplexet i membranet och bildar ett mörkfärgat band. Reaktionen kan ske omedelbart eller kräva upp till 30 minuter innan banden blir synliga.
- Dokumentera resultaten. Slå in membranet helt i cellofan och placera det direkt på gelavbildaren. Gelavbildaren fotograferar de band som visas på Western blot-membranet, vilket ger en permanent dokumentation av analysresultatet.
