Agarosgelelektrofores är den vanligaste metoden för visuell analys av DNA-fragment. Metoden gör det möjligt att skilja åt DNA-fragment beroende på storlek: eftersom DNA är negativt laddat vandrar det mot pluspolen (anoden) när en elektrisk spänning läggs över gelen. Små fragment rör sig snabbare genom gelens porer, medan större fragment rör sig långsammare. Genom att färga DNA:t med ett fluorescerande mellankalade ämne, exempelvis etidiumbromid, blir banden synliga under UV-ljus – vilket gör att flera elektroforesprover kan jämföras direkt på samma gel.
Nedan följer en komplett guide till hur du förbereder en agarosgel, laddar dina DNA-prov och analyserar resultaten.
Det här behöver du
- Agarospulver för en gel på 0,7–2 procent
- Buffert: Tris-borat-EDTA (TBE), tris-acetat-EDTA (TAE), litiumacetat (LA) eller natriumborat (SB)
- Etidiumbromid
- Gelbelastningsfärg (loading dye)
- Gelträg
- Elektroforeskammare
- Handskar
- Skyddsglasögon
- Pipetter
- Elektroforeskam
Säkerhetsnotering: Etidiumbromid är en misstänkt mutagen. Använd alltid handskar och skyddsglasögon vid hantering och följ laboratoriets rutiner för avfallshantering.
Instruktioner
Förbereda en 0,7-procentig agarosgel
- Väg upp agarosen. Väg upp 0,7 gram agarospulver och lägg det i en stor Erlenmeyerkolv (250 ml).
- Tillsätt buffert. Tillsätt 100 ml buffert med styrkan 1X (TAE, TBE, SB eller LA) till kolven som innehåller agarospulvret.
- Lös upp agarosen. Värm lösningen i mikrovågsugn eller med gasbrännare i cirka en minut, tills vätskan är helt klar och agarosen har löst sig helt.
- Låt lösningen svalna. Ta bort kolven från värmekällan och låt lösningen svalna till 55–60 °C.
- Tillsätt färgämnet. Tillsätt 1 mikroliter etidiumbromid till den avsvalnade agaroslösningen med en lämpligt stor pipett (vanligtvis 1 ml). Svirla försiktigt för att blanda.
- Häll i gelen. Häll gelen långsamt i gelträget och se till att inga bubblor bildas under gjutningen. Följer inga brunnstoppar med gelträget kan du använda maskeringstejp för att forma brunnarna.
- Placera kammen. Sätt försiktigt ned elektroforeskammen i gelen så att den sitter stadigt och i rätt orientering. Kammar finns med olika antal tänder beroende på hur många prover du ska köra. Låt gelen stelna i ungefär 25 minuter.
- Sänk ned gelen. Överskölj gelen med samma buffert som användes vid beredningen av agaroslösningen – i det här fallet en 1X-buffert. Använd upp till 5 ml körbuffert så att gelen ligger helt under ytan.
Förbereda och ladda DNA i gelen
- Förbered proven. Överför 5–10 mikroliter av dina prover från reaktionsrören till nya rena rör. Vill du använda hela reaktionsblandningen behövs inte ett nytt rör.
- Tillsätt lastbuffert. Tillsätt lastbuffert med styrkan 0,2X till vart och ett av de nya rören som innehåller ditt DNA-prov.
- Ta bort kammen. Dra långsamt upp elektroforeskammen ur gelen. Var noga med att inte spräcka gelen eller skapa en luftspalt mellan gelens undersida och gelträget.
- Ladda DNA-markören. Tillsätt 5–12 mikroliter av en lämplig DNA-markör (storleksladder) i den första brunn som bildats av kammen. Vilken markör som passar beror på storleken på de fragment du förväntar dig i dina prover.
- Ladda proverna. Ladda 5–10 mikroliter av dina prover i de övriga brunnarna och avsluta med samma mängd av samma DNA-markör i den sista brunnen.
- Koppla in elektroderna. Placera elektroderna i elektroforeskammaren genom att ansluta ledningarna till korrekta uttag och ställ in spänningen till 50–150 V.
- Kör elektroforesen. Låt gelen löpa i en till fyra timmar, beroende på hur bra separation du behöver.
Analysera resultaten
- Visualisera gelen. Ta bort gelen från kammaren och placera den antingen i ett UV-rum för visuell identifiering eller i en apparat som kan dokumentera gelen fotografiskt.
- Mät markörerna. Mät de avstånd som markörbanden har vandrat från sina respektive brunnar.
- Skapa en standardkurva. Plotta avstånden mot bandens storlekar på semilogaritmiskt diagramblad och rita en utjämnad bästa-passningslinje.
- Mät de okända banden. Beräkna de avstånd som dina okända band har vandrat.
- Uppskatta storlekarna. Dra en linje uppåt från det avstånd som ett okänt band vandrat, tills linjen möter bästa-passningslinjen.
- Avläs storleken. Dra därefter en horisontell linje från skärningspunkten över till storleksaxeln – där kan du avläsa uppskattad storlek på ditt DNA-fragment.
Med lite övning ger agarosgelelektrofores en snabb, enkel och pålitlig bild av storleken på dina DNA-fragment – en grundläggande teknik inom molekylärbiologi som används allt från kloningskontroller till genotypning.
