Antikroppsmärkning omfattar flera laboratorietekniker som används inom biovetenskaperna för att påvisa närvaron av specifika molekyler. Metoderna utnyttjar den naturliga relationen mellan ett antigen och en antikropp. Ett antigen kan vara vilken molekyl som helst som immunsystemet känner igen, medan en antikropp är ett Y-format protein som specifikt känner igen ett enda antigen. Forskare använder bindningsrelationen mellan antikropp och antigen för att avgöra var en viss molekyl finns i ett prov.
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) är en biologisk laboratoriemetod som används för att detektera förekomsten av ett antigen eller en antikropp. Den används ofta inom medicinsk diagnostik för att avgöra om en patient har utsatts för en viss typ av infektion.
För att utföra en ELISA fästs provet, som innehåller antigenet av intresse, vid ett fast underlag i en skål. En lösning med den kompletterande antikroppen tillsätts, och antikroppen binder till antigenet. Överskottet av antikroppar tvättas därefter bort, så att endast bundna antigen-antikroppspair återstår i skålen. Dessa kan visualiseras genom att tillsätta en fluorescerande molekyl som binder till antikroppen och avger en synlig signal som kan kvantifieras. På detta sätt kan närvaron och mängden av antigenet av intresse indirekt bestämmas.
Western blot är en annan teknik som används för att detektera ett specifikt protein i ett prov och samtidigt bestämma dess storlek. Först separeras provets proteiner efter storlek på en gel med hjälp av gelelektrofores. Vid det här laget är proteinerna inte synliga för blotta ögat. Forskarna överför därefter proteinerna till ett membran och tillsätter en lösning som innehåller antikroppar mot antigenet av intresse. När överskottslösningen tvättats bort är antikropparna bundna till antigenet på membranet.
Tillsats av en sekundär antikropp gör att den ursprungliga, primära antikroppen avger ljus. Genom att mäta mängden utsänt ljus kan forskarna fastställa förekomsten av antigenet, dess storlek jämfört med andra proteiner samt dess relativa koncentration.
Immunhistokemi är en teknik som gör det möjligt för forskare att visualisera var ett protein finns i ett vävnadsprov. Tunna skivor av provet prepareras och en primär antikropp, som fäster vid antigenet av intresse, tillsätts. Överskottslösningen tvättas bort innan forskarna tillsätter en sekundär antikropp. Denna fäster vid paret bestående av primär antikropp och antigen och avger ljus, vilket signalerar var antigenet finns.
Forskare använder ett mikroskop för att se exakt var antigenet befinner sig i cellen. Flera olika antikroppar, var och en specifik för ett visst protein, kan användas för att bestämma den relativa placeringen av flera molekyler i en cell. Om detta är målet används sekundära antikroppar i olika färger för att skilja åt de olika molekylerna av intresse.
Fluorescensaktiverad cellsortering, eller FACS, är en typ av flödescytometri som används för att separera olika celltyper i en lösning. Varje celltyp märks med en antikropp som är specifik för just den celltypen, och varje antikropp avger ljus i en unik färg. En maskin omrörer lösningen så att den delas upp i enskilda droppar och använder en sensor för att detektera färgen på varje droppe. Maskinen sorterar cellerna efter utsänd färg och delar upp dem baserat på vilken typ av protein de innehåller. FACS-metoden gör det möjligt för forskare att sortera och kvantifiera de celler som är relevanta för deras forskningsfrågor.
Vanlig elektronmikroskopi gör det möjligt för forskare att studera en cells struktur förstorad upp till en miljon gånger. Immuno-elektronmikroskopi utnyttjar egenskaperna hos bindningen mellan antikropp och antigen för att visualisera specifika proteiner i mycket tunna vävnadssnitt. Antikroppar försedda med guldpartiklar får först binda till antigenet av intresse. Ett elektronmikroskop visualiserar därefter guldpartiklarna, vilket ger forskarna en bild av var proteinet är lokaliserat i cellen.
Även om immuno-elektronmikroskopi är enkel i teorin, är den tekniskt krävande och mycket dyr att använda, vilket begränsar dess popularitet inom många biologiska forskningsprogram.
Val av metod beror på forskningsfrågan: ELISA passar för kvantitativ detektion i lösning, Western blot för identifiering och storleksbestämning av proteiner, immunhistokemi för lokalisering i vävnader, flödescytometri för sortering av celltyper, och immuno-elektronmikroskopi för extremt högupplöst lokaliseringsstudier. Tillsammans utgör dessa antikroppsbaserade tekniker grundläggande verktyg inom modern biomedicinsk forskning och diagnostik.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online