Så mäter du cellviabilitet med trypanblått – komplett steg-för-steg-guide

Inom de flesta biologiska experiment som bygger på cellkultur är det avgörande att kunna avgöra vilka celler i provet som lever och vilka som är döda. Den vanligaste metoden för att bedöma detta är färgexklusion (dye exclusion). Metoden bygger på att levande celler har intakta cellmembran som stänger ute färgämnet, medan döda cellers skadade membran släpper in det – vilket gör att döda celler färgas blåa i cytoplasman.

Det finns flera olika färgämnen och protokoll att välja mellan, och ditt val bör baseras på kostnad, känslighet samt metodens enkelhet och tidsåtgång. Trypanblått är ett av de mest använda färgämnena eftersom hela proceduren kan genomföras på fem till tio minuter och endast kostar själva reagenset.

Du behöver följande material

• Trypanblåttsreagens, 0,4 %
• Bürkers räknarkammare (hemocytometer)
• Täckglas
• Mikropipett
• Pipettspetsar
• Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
• Ljusmikroskop

Instruktioner steg för steg

1. Förbered cellpelleten

Börja med att ta fram ett pellet av de celler du vill analysera, till exempel efter centrifugering.

2. Resuspendera cellerna i PBS

Suspendera om cellpelleten i PBS till en koncentration på cirka 5 × 10⁵ celler/ml. PBS används eftersom viabilitetsmätningen blir mer tillförlitlig i serumfri miljö – serumproteiner kan annars själv färgas och ge missvisande resultat.

3. Blanda cellsuspensionen med trypanblått

Tillsätt lika delar cellsuspension i PBS och lika delar 0,4 % trypanblåttsreagens för att få en utspädning på 1:2 (exempel: 100 µl celler till 100 µl trypanblått). Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner.

4. Inkubera kort

Låt blandningen inkubera i högst tre minuter i rumstemperatur. Räknar du cellerna först efter ungefär fem minuter blir viabilitetsmätningen opålitlig, eftersom trypanblåttet då börjar döda även friska celler.

5. Fyll räknarkammaren

Med täckglaset redan på plats, fyll varje sida av Bürkers räknarkammare med cellsuspensionen. Vanligtvis krävs det 10–20 µl per sida.

6. Placera under mikroskopet

Lägg räknarkammaren på objektbordet hos ett ljusmikroskop och fokusera på cellerna.

7. Räkna cellerna

Varje sida av räknarkammaren består av flera rutnät med kvadrater. Räkna det totala antalet celler i en kvadrat. Räkna sedan separat antalet icke-viabla (blåfärgade) och viabla (ofärgade/klara) celler i samma kvadrat.

8. Beräkna viabiliteten

Beräkna procentandelen viabla celler i kvadraten genom att dividera antalet viabla celler med det totala antalet celler och multiplicera med 100. Upprepa beräkningen för flera kvadrater i räknarkammaren för att få fram ett genomsnittligt värde för cellviabiliteten.

Tips: Genom att räkna flera kvadrater minskar du risken för slumpmässiga fel och får ett mer representativt resultat för hela din cellkultur.