Direkt eller indirekt ELISA – så skiljer sig metoderna åt

Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) bygger på att ett antikropp–enzym-komplex reagerar med ett antigen eller en antikropp som är immobiliserad på en fast yta. När det konjugerade enzymet inkuberas med ett lämpligt substrat bildas en produkt. Produktbildningen gör det möjligt att påvisa förekomsten av antigenet eller antikroppen, och mängden produkt ger ett mått på hur omfattande antigen-antikropp-reaktionen har varit.

ELISA kan utföras i två huvudformer: direkt och indirekt. Nedan går vi igenom de viktigaste skillnaderna mellan metoderna.

Testformat

Direkt ELISA

Vid direkt ELISA är en primärantikropp fäst på väggarna i en mikrotiterplatta. När provet som misstänks innehålla antigenet tillsätts sker en antigen-antikropp-reaktion. Därefter tillsätts en enzymkonjugerad antikropp som kan reagera med antigenet. Om antigen finns i provet binder den till detta enzymkonjugerade antikropp. När ett färglöst substrat sedan tillsätts utvecklas en färg om antigenet finns närvarande.

Indirekt ELISA

Vid indirekt ELISA är det istället antigenet som är fäst på mikrotiterplattans väggar. När ett prov som misstänks innehålla antikroppar tillsätts sker en antigen-antikropp-reaktion. Därefter tillsätts en enzymkonjugerad sekundärantikropp som kan reagera med den obundna regionen av antikroppen. När det färglösa substratet tillsätts utvecklas en färg om provet innehåller antikroppar.

Enkelhet vid testning

Ett brett sortiment av märkta sekundärantikroppar finns kommersiellt tillgängligt. Dessutom kan flera olika primärantikroppar framställas i samma djurart, vilket innebär att samma sekundärantikropp kan användas för detektering. Detta gör indirekt ELISA enkel att utföra i praktiken.

Vid direkt ELISA måste primärantikropparna däremot specifikt framställas för att reagera med just det antigen som misstänks finnas i provet. Detta ger den direkta metoden en tydlig nackdel jämfört med den indirekta varianten.

Hastighet

Den direkta ELISA-testen går snabbare att genomföra än den indirekta, eftersom endast en antikropp används. Den indirekta ELISA kräver ett extra inkubationssteg med en andra antikropp under testförfarandet, vilket födröjar tidpunkten då resultatet kan avläsas.

Känslighet

Den direkta ELISA-testen är mindre känslig än den indirekta formen, eftersom signalförstärkningen är betydligt mindre. Dessutom kan enzymmärkningen av primärantikroppen försämra dess immunoreaktivitet.

Vid indirekt ELISA är primärantikroppen omärkt och behåller därför sin immunoreaktivitet. Varje primärantikropp har dessutom många epitoper som kan binda sekundärantikroppen, vilket möjliggör en kraftig signalförstärkning och därmed förbättrar metodens känslighet.

Det finns dock en risk för korsreaktivitet mellan antigenet och sekundärantikroppen vid indirekt ELISA, vilket kan leda till felaktiga resultat. En sådan risk finns inte vid den direkta metoden.

Sammanfattning av skillnaderna

Sammanfattningsvis väljs direkt ELISA när snabbhet och låg korsreaktivitet är viktigast, medan indirekt ELISA föredras när hög känslighet och praktisk flexibilitet står i fokus.