Dot blot-protokoll: Metoder för detektering av biomolekyler

Vad är dot blot?

En dot blot, eller slot blot, är en teknik som molekylärbiologer använder för att detektera biomolekyler genom att applicera en blandning som innehåller biomolekylerna direkt på ett membran i form av en prick. Nukleotidsonder eller antikroppar används sedan för att påvisa biomolekylerna.

Denna metod bekräftar närvaron eller frånvaron av specifika biomolekyler, men ger ingen information om biomolekylens storlek. Därför krävs andra tester för mer detaljerade analyser.

Southern blot

Southern blotting är en metod som detekterar specifika DNA-sekvenser. Tekniken kombinerar överföringen av DNA-fragment, som tidigare separerats kemiskt, till ett filtermembran med detektering av fragmenten genom sondhybridisering.

Med Southern blot kan forskare bestämma antalet sekvenser, eller genkopior, i ett genom. Metoden är uppkallad efter den brittiske biologen Edwin Southern, som utvecklade den år 1975.

Northern blot

Northern blotting används för att studera genuttryck genom att detektera RNA i ett prov. Med denna teknik går det att observera hur en cell styr sin struktur och funktion.

Metoden gör det möjligt att fastställa specifika genuttryck under cellens olika utvecklingsstadier, liksom vid onormala eller sjukliga tillstånd.

Northern blotting separerar RNA-prov efter storlek och detekterar delar av hela målsekvensen. En forskargrupp vid Stanford University utvecklade metoden år 1977.

Western blot

Western blot, även kallad proteinimmunoblot, detekterar specifika proteiner i ett vävnadsprov. Tekniken bygger på gelelektrofores, som separerar nativa eller denaturerade proteiner efter polypeptidlängd eller proteinets struktur.

Efter att proteinerna har överförts till ett membran använder forskarna antikroppar som är specifika för målproteinet för att påvisa dem.

Western blotting används kliniskt för att diagnostisera bland annat hiv, galna ko-sjukan, vissa former av borrelia (Lymes sjukdom), hepatit B och katt-aids (FIV).

Southwestern blotting

Southwestern blotting innebär identifiering och karakterisering av DNA-bindande proteiner genom deras förmåga att binda till specifika sonder.

Processen, som utförs med gelelektrofores följt av överföring till specifika membran, kombinerar principerna bakom både Southern blotting och Western blotting.