Flödescytometri är en kraftfull metod för att studera proteiner i celler. Tekniken bygger på att mäta ljus- eller fluorescensemission från proteiner inuti cellen. Genom att använda antikroppar eller prober märkta med fluorescerande ämnen kan specifika proteiner analyseras med hög precision. Flödescytometri används både inom sjukvården för att diagnostisera sjukdomar som cancer och inom medicinsk forskning.
För att bevara stabiliteten hos de intracellulära proteinerna måste cellerna först fixeras. Det finns flera lämpliga fixeringsmedel, exempelvis formaldehyd eller iskall aceton. Efter fixeringen behöver cellmembranet permeabiliseras, det vill säga göras genomsläppligt, så att antikropparna kan tränga in i cellen. Detta åstadkoms med detergenter som Triton X-100 eller NP-40, alternativt med iskall metanol, vilka skapar små öppningar i cellmembranet.
Börja med att tvätta cellerna i blockeringsbuffert bestående av 0,5 procent bovint serumalbumin utspätt i fosfatbuffrerad saltlösning (BSA/PBS). Cellerna inkuberas i blockeringsbufferten för att minska den icke-specifika bindningen. Tillsätt därefter primärantikropp, utspädd i blockeringsbuffert, och låt provet inkubera i rumstemperatur under en optimerad tidsperiod. Avsluta steget med att återigen tvätta cellerna i blockeringsbuffert.
Inkubera nu sekundärantikroppen, som är märkt med en fluorescerande etikett, i rumstemperatur i 30 minuter. För att avlägsna antikroppar som inte bundit tvättas cellerna i blockeringsbuffert. Centrifugera därefter cellerna till en pellet och resuspendera dem i PBS. Provet är nu redo att analyseras i flödescytometern.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online