HPLC-teknik: Så fungerar högpresterande vätskekromatografi

HPLC står för high-performance liquid chromatography, på svenska högpresterande vätskekromatografi. Det är en standardiserad analysmetod för både kvalitativ och kvantitativ analys som används rutinmässigt inom analytiska laboratorier. Tekniken är pålitlig och reproducerbar, vilket gör den till det självklara valet när molekyler ska separeras, identifieras och kvantifieras ur komplexa blandningar av kemiska och biologiska komponenter.

Fyra huvudkomponenter

HPLC-systemet bygger på fyra viktiga delar:

1. Lösningsmedelssystemet (den mobila fasen) – pumpar och transporterar provet genom kolonnen. Polariteten i den mobila fasen är avgörande, eftersom den direkt påverkar systemets förmåga att separera olika molekyler.

2. Kolonnen med adsorbens (den stationära fasen) – kolonnen är oftast en vertikal glaskolonn fylld med ett adsorbens, vanligtvis kiseldioxidgel (silikagel) eller aluminiumoxid. Eftersom denna fas inte rör sig kallas den stationär.

3. Provinsprutningssystemet – består av en injektionsport där provet som ska analyseras förs in i lösningsmedelsflödet.

4. Detektorn – registrerar de separerade ämnena och omvandlar signalen till data som kan analyseras.

Detektorer

Vilken detektor som väljs beror på vilken typ av prov som analyseras och vilka molekyler teknikerna vill isolera. Vid val av detektor beaktas kriterier som selektivitet, signal-brusförhållande, detektionsgräns, linjärt område, tidskonstant, drift och cellvolym.

Bland de vanligaste detektorerna finns UV-Vis-detektorer (ultraviolett-synligt ljus), masspektrometrar, brytningsindexdetektorer, fluorescensdetektorer samt evaporativ ljusspridning (ELSD).

Arbetsgång steg för steg

1. Starta utrustningen. Slå på detektorn, pumparna (som skapar det tryck som driver den mobila fasen genom den stationära) och datorn som registrerar och skriver ut kromatogrammet.
2. Välj rätt program. Konfigurera mjukvaran så att önskad data samlas in korrekt.
3. Injicera provet. För in provet i injektionsporten.
4. Övervaka trycket. Varje kolonntyp har en maximalt tillåten pressure – överskrids denna sker ingen korrekt separation.
5. Analysera resultaten. Skriv ut kromatogrammet och tolka resultaten.
6. Spola systemet. Efter varje körning är det viktigt att spola rengöra injektionsporten för att förhindra ansamlingar som kan orsaka blockeringar.

Olika typer av HPLC

Hydrofil interaktionskromatografi (HILIC) använder en bunden polar stationär fas tillsammans med en opolär, vattenblandbar mobil fas för att separera molekyler efter polaritet. Metoden kan separera sura, basiska och neutrala prover i ett och samma kromatogram.

Normalfas-kromatografi kombinerar en polär stationär fas med en opolär, icke-vattenhaltig mobil fas och används ofta för att separera strukturisomerer – molekyler med samma summaformel men där atomerna är bundna på olika sätt.

Omfas-kromatografi (reversed phase) är den mest använda HPLC-varianten. Här är den stationära fasen opolär medan den mobila fasen är vattenhaltig och något polär. Läkemedelsföretag använder metoden flitigt för att kvalitetssäkra läkemedel innan de släpps på marknaden.

Gelpermeationskromatografi (storleksuteslutning) separerar molekyler efter storlek och kan även användas för att bestämma proteiners struktur.

Jonbyteskromatografi bygger på attraktionen mellan joner i provet och laddade bindningsställen på den stationära fasen.

Användningsområden

HPLC är en mångsidig teknik med bred tillämpning. Inom läkemedelsindustrin används den både för att forska fram nya läkemedel och för att ren befintliga preparat. Tekniken används också för att analysera biologiska vätskor, bekämpningsmedel, sprängämnen och många andra material.

Även om HPLC är särskilt populär inom biomedicinsk, biokemisk och farmaceutisk forskning, spelar den en viktig roll även inom kosmetika-, livsmedels-, miljö- och energisektorerna – överallt där exakt separation och kvantifiering av molekyler krävs.