Retrovirus är en unik grupp virus som bär på ett RNA-genom, inkapslat i ett kapsid och omgivet av ett lipidhölje. Deras polypeptidkedjor gör det möjligt för dem att binda till receptorer i membranet på de värdceller de infekterar. Medan de flesta cellers ärftliga information lagras i DNA, finns retrovirusens genetiska material i RNA. Retrovirus bär dessutom på enzymet revers transkriptas, vilket gör att de kan integrera sitt genetiska material i värdcellens DNA. I laboratoriemiljö följs specifika protokoll när celler medvetet infekteras med dessa virus.
Innan arbetet med retroviral infektion kan påbörjas krävs viss utrustning och vissa material. Utrustningen omfattar en pipetthjälp, en pipettman, ett vävnadskulturkåpa, inkubatorer med temperaturer på 37 °C respektive 32 °C samt en Eppendorf-centrifug. Bland materialen som behövs finns vävnadskulturskålar, engångspipetter av Pasteur-typ, kvalitetskontrollerat retroviralt supernatant, filtersteriliserat polybren och filtersteriliserat protaminsulfat.
Innan infektionen påbörjas måste målcellerna odlas ut i en vävnadskulturskål och inkuberas över natten i en inkubator på 37 °C med fem procent koldioxid (CO2). Syftet med inkubationsperioden är att uppnå cellkonflvens på cirka 50 procent. Att förbereda cellerna i förväg är avgörande för att säkerställa att de är optimalt anpassade för infektionsprocessen. Nolan-laboratoriet vid Stanford University rekommenderar att man alltid börjar med att infektera NIH 3T3-celler, eftersom detta hjälper till att optimera resultatet av försöket.
När inkubationsperioden är slut ska forskarna kontrollera att cellerna både är friska och har rätt konflvens. Med hjälp av vävnadskulturkåpan aspireras cellmaterialet, varefter viralt supernatant tillsätts till cellerna. Efter tillsatsen ska skålen gunga varsamt fram och tillbaka så att lösningen fördelas jämnt. Därefter sker spininokulering genom att cellerna placeras i Eppendorf-centrifugen och centrifugeras i 90 minuter vid 2 500 varv per minut och en temperatur på 30 °C. Cellerna inkuberas sedan vid 32 °C i en till två dagar. Viruset byts därefter ut mot extraherade celler som placeras i inkubatorn för analys tre till sju dagar efter den ursprungliga infektionen.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online