Protokoll för frysning av celler – steg för steg

Att bevara celler genom frysning är avgörande inom forskning, veterinärmedicin och djuravel, eftersom det gör det möjligt att lagra celler under mycket långa perioder utan att de förlorar sina egenskaper. Den valda frysningsmetoden måste dock minska eller helt förhindra skador på cellerna. Vilket kryoprotektionsmedel och vilken metod som används kan variera beroende på celltyp.

Förberedelse

Celler bör frysas när de är friska och aktivt växande, med en livsduglighet på minst 90 procent. Varsamhet ska iakttas vid all hantering – undvik höghastighetscentrifugering samt kraftig pipettering och sugning, eftersom detta kan skada cellmembranen och sänka livsdugligheten. En skonsam hantering genom hela processen är avgörande för ett lyckat resultat.

Kryoprotektion

Ett kryoprotektionsmedel används som ersättning för det intracellulära vattnet och förhindrar att iskristaller bildas samt att cellerna torkar ut under frysningsprocessen. Steriliserad glycerol och steriliserat dimetylsulfoxid (DMSO) är de mest använda medlen och tillsätts vanligen i en koncentration på 5 till 15 procent (volym per volym), utspädda i antingen fostercalvserum eller odlingsmedium beroende på celltyp. DMSO är oftast valet för däggdjursceller, medan glycerol ofta föredras för exempelvis bakterier.

Frysning och lagring

Cellerna i frysblandningen ska kylas ned långsamt, helst med en hastighet på cirka 1 grad Celsius per minut. Om en programmerbar frysenhet inte finns tillgänglig kan kryoflaskor lindas in i vävnadspapper eller placeras i frigolit, vilket hjälper till att sakta ner frysningsprocessen. Låt cellerna förvaras vid minus 80 grader Celsius i 24 timmar och överför dem därefter till flytande kväve för långtidsförvaring, där de kan hållas i årtionden utan betydande kvalitetsförlust.

Upptining

Till skillnad från frysningen ska frysta celler tinas snabbt. Ett vattenbad vid 37 grader Celsius fungerar väl för ändamålet. Observera dock stor försiktighet vid hantering av celler som förvarats i flytande kväve – kväve kan tränga in i flaskorna och orsaka att de exploderar vid upptining. Använd därför skyddsutrustning och öppna flaskorna försiktigt.

Efter upptiningen ska frysblandningen spädas ut i färskt odlingsmedium. Bedöm därefter cellernas livsduglighet med färgämnet trypanblått, som färgar döda celler blå, och odla sedan cellerna enligt normal rutin.