Gelelektrofores är en laboratoriemetod för att separera, identifiera och karakterisera blandningar av proteiner eller nukleinsyror. När elektrisk spänning tillförs vandrar denaturerade prover genom en tunn, fuktig gel som vanligtvis tillverkas av polyakrylamid eller agaros. Därefter färgas de separerade komponenterna så att de blir synliga.
Metoden används flitigt inom protein- och nukleinsyreforskning samt på sjukhus och kliniska laboratorier, där den hjälper till att identifiera onormala proteiner eller DNA-mönster vid diagnostik av sjukdomar, genetiska defekter och släktskapsutredningar.
När ett detergentmedel, exempelvis natriumdodecylsulfat (SDS), tillsätts till ett prov binder det till proteinerna eller nukleinsyrorna och vecklar ut dem – en process som kallas denaturering. Denatureringen ger molekylerna en jämn laddning i proportion till deras längd, vilket gör det möjligt att bestämma deras molekylvikt under elektroforesen.
Den mängd prov som behövs varierar beroende på typ av analys: normalt krävs cirka 100–500 nanogram per band för proteiner och 5–100 nanogram per band för nukleinsyror, i en totalvolym på omkring 25–40 mikroliter.
Gelen kan antingen tillverkas i laboratoriet eller köpas färdig och består oftast av polyakrylamid eller agaros. Den liknar gelatin – mestadels vatten, men ändå fast nog att hanteras. Buffert tillsätts för att hålla pH-värdet stabilt under körningen.
Gelen är mycket tunn, vanligen 1–2 mm tjock, och rektangulär. I ena änden finns fördjupningar som kallas brunnar. Det är här proverna senare läggs i.
Gelen placeras i en elektroforeskamare fylld med buffert, varefter de denaturerade proverna försiktigt läggs i brunnarna. I de yttersta brunnarna tillsätts referensprover med känd molekylvikt, så kallade markörer, som används som jämförelse.
Procenthalten polyakrylamid i gelen avgör vilka molekylstorlekar som kan separeras effektivt. En gel med låg koncentration (cirka 4 procent) passar bäst för stora molekyler med hög molekylvikt, medan en mer koncentrerad gel (cirka 12 procent) används för mindre molekyler. En gradientgel, vars koncentration varierar längs gelens höjd, kan separera ett brett spektrum av proteiner men med något lägre upplösning.
När en hög elektrisk spänning kopplas in börjar de denaturerade proteinerna vandra nedåt genom gelen. Ju tyngre molekylen är, desto långsammare rör den sig, eftersom små molekyler lättare passerar genom gelens porer. När strömmen stängs av stannar molekylerna på sina platser.
Gelen tas sedan ur kamaren och placeras i en skål med färglösning som rockas fram och tillbaka för en jämn färgning. Proteiner färgas ofta med organiska färgämnen som Coomassie-blått eller metallfärgämnen, medan fluorescerande ämnen som etidiumbromid används för nukleinsyror.
Efter att överflödig färg tvättats bort syns provblandningen som ett mönster av band, nästan som en stege. Genom att jämföra bandens positioner med hur långt standardproverna vandrat går det att bestämma molekylvikten hos provet i varje band.
Gelen kan dehydreras med alkohol och torkas för att sparas som dokumentation. Bandens färgintensitet kan dessutom mätas för att beräkna koncentrationen av proteinet i respektive band.
För välkända proteiner finns färdiga standardprotokoll. Arbetar forskaren däremot med ett obekant prov kan flera parametrar behöva optimeras – gelstyrka, bufferttyp, pH-värde, spänning, körtid och färgningsmetod – för att uppnå bästa möjliga separation och signalstyrka.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online