Kloramfenikol är ett bredspektrumantibiotikum som dödar bakterier genom att störa deras förmåga att föröka sig. Läkemedlet utvecklades ursprungligen för att behandla infektioner hos människor, men enligt Drug.com används det numera endast som en sista utväg när andra antibiotika inte fungerar. Orsaken är de allvarliga biverkningar substansen kan orsaka, bland annat aplastisk anemi, hypoplastisk anemi, trombocytopeni och granulocytopeni.
Inom forskningen har kloramfenikol dock fortsatt stor betydelse. I molekylärbiologiska laboratorier är antibiotikumet ett värdefullt verktyg: när det blandas in i odlingsplattor kan det användas för att bestämma bakteriekoncentrationer eller för att isolera specifika bakteriestammar för vidare experiment.
Kloramfenikol är giftigt och kan tas upp genom huden. Använd därför alltid skyddshandskar, labbrock och skyddsglasögon när du hanterar substansen. Arbeta dessutom sterilt genom hela processen för att undvika att dina plattor kontamineras.
Ta på dig latex- eller nitrilhandskar innan du börjar förbereda LB-buljongen. LB är en vanlig förkortning för lysogenybuljong (Lysogeny broth), även kallad Luriabuljong, och används som odlingsmedium för bakterier. Buljongen kan tillverkas från grunden i laboratoriet, eller köpas färdig från en leverantör av molekylärbiologiska material för att spara tid.
Lägg ett vägpapper på vågen och nollställ den så att papprets vikt inte räknas med. Tillsätt små mängder trypton åt gången tills du når 10 gram. Vik sedan ihop pappret med tryptonet i mitten och använd det försiktigt som tratt när du häller i 2-literskolven. Upprepa samma procedur för att väga upp 5 gram jästextrakt, 10 gram NaCl och 15 gram agar.
Släpp ner omrörarmagneten i kolven och centrera kolven på magnetomröraren. Tillsätt destillerat vatten tills lösningen når upp till 1 liter.
Slå på magnetomröraren och håll koll på omrörarmagneten. Hastigheten ska vara inställd så att magneten snurrar i måttlig takt utan att fastna mot kolvens kanter – justera vid behov. Låt lösningen stå kvar tills alla reagens har löst sig helt.
Stäng av magnetomröraren. Spänn ett kvadratiskt stycke parafilm, cirka 7,5 centimeter, över kolvens öppning så att innehållet skyddas mot föroreningar och spill. Täck därefter parafilmen med aluminiumfolie och fäst en bit autoklavtejp på folien.
Ställ in lösningen i autoklaven och kör vätskeprogram i 20 minuter vid 15 psi (ungefär 1 bar) för att sterilisera buljongen.
Ta ut kolven ur autoklaven – kom ihåg att den är mycket het. Låt lösningen svalna till cirka 55 °C, antingen genom att ställa kolven i rumstemperatur eller genom att placera den i ett vattenbad på 65 °C.
Spraya och torka av arbetsytan med 95-procentig etanol för att förhindra kontaminering. Byt gärna också handskar innan du hanterar plattorna.
Dra ett vertikalt blått band på sidan och locket på varje platta med markerpennan. Märket visar att plattorna innehåller både LB-buljong och kloramfenikol.
Tillsätt kloramfenikol i den mängd som krävs för önskad slutkoncentration, beroende på vilka bakterier du ska arbeta med. En vanlig slutkoncentration är 100 mikrogram per milliliter. För den koncentrationen tillsätter du 1 milliliter kloramfenikollagerlösning (25 mg/ml). Snurra kolven i cirklande rörelser eller ställ tillbaka den på magnetomröraren i 1–2 minuter så att lösningen blandas ordentligt.
Torka av kolvens mynning med etanol och häll sedan lösningen i plattorna tills de är ungefär halvfulla. Låt plattorna stelna, sätt på locken och förvara dem uppochner vid 4 °C så att de inte torkar ut.
Förvara kloramfenikollagerlösningen fryst vid −20 °C och skydda den från ljus, eftersom substansen är ljuskänslig. Använd de färdiga plattorna inom några veckor för bästa resultat, och kontrollera alltid vilken koncentration som rekommenderas för just din bakteriestam innan du börjar.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online