Polyakrylamidgelelektrofores, eller PAGE, är en teknik som ofta används för att separera organiska molekyler i ett biologiskt prov. Molekyler med lägre storlek och vikt vandrar snabbare genom en polyakrylamidgel när elektrisk ström appliceras. Tydliga och distinkta band observeras normalt efter att den färdiga gelen har inkuberats i ett lämpligt färgämne.
Det är en relativt enkel metod, men frånvaro av band eller band som är suddiga eller orena kan tyda på ett problem i ett eller flera steg av proceduren. När resultaten inte blir som förväntat bör du följa grundläggande riktlinjer för felsökning av gelelektrofores.
Starta felsökningen med det sista steget i gelelektroforesen och arbeta sedan bakåt i processen. Det sista steget är färgningsproceduren som används för att visualisera provbanden. Få problem brukar faktiskt uppstå under själva färgningen. Pulverfärgämnen bör dock lösas upp ordentligt i rätt buffert innan de används, och du bör kontrollera att korrekt koncentration av färgämnet användes.
Frånvaro av band kan tyda på att ström- eller spänningsinställningen var för hög, vilket innebär att testproven vandrade ut ur gelen. Höga inställningar kan också få provkomponenterna att vandra genom gelen för snabbt, vilket ger sämre upplösning och orena band. Om inställningen istället är för låg kanske proven inte vandrar alls. Proven kan även driva bort från brunnarna där de laddades utan att vandra genom gelen.
Kontrollera det flytande akrylamidet som användes för att gjuta polyakrylamidgelen. Procenthalten akrylamid ligger vanligtvis mellan 5 och 15 procent. Prov som består av större molekyler körs på en 5-procentig gel, eftersom stora fragment rör sig långsammare i geler med högre akrylamidhalt. Små molekyler körs däremot på en gel med högre procenthalt, eftersom en låg gelformel inte klarar av att separera mindre prover.
En polyakrylamidgel bildas genom polymerisering av en flytande blandning bestående av bisakrylamid och akrylamid. Ammoniumpersulfat och TEMED tillsätts för att katalysera gelbildningen. Normalt bör akrylamidet visa tecken på polymerisering cirka 15 minuter efter tillsats. Polymerisering som sker för snabbt beror oftast på för höga mängder ammoniumpersulfat, medan för lite ammoniumpersulfat kan ge en ofullständig eller ojämn polymerisering.
Höga provkoncentrationer kan röra sig trögt genom gelen och minska bandupplösningen. En för låg provkoncentration kanske inte syns alls efter färgningen, eftersom dessa färgämnen har begränsningar för den minsta mängd prov som kan detekteras beroende på färgens känslighet.
Salter och andra föroreningar i ett prov kan påverka provets rörelse genom gelen. Elektrofores bygger på att elektrisk ström passerar genom en gel som innehåller en strömledande buffert, och höga saltkoncentrationer i provet kan störa strömmens väg genom gelen. Använd därför ett reningskit vid provisoleringen så att du får ett relativt rent prov.
Läs igenom relevant litteratur eller den skriftliga protokollet för att avgöra om rätt PAGE-metod användes för experimentet. Andelen akrylamid i PAGE är specifik för storleken på provet som ska analyseras. Litteraturen kan också ge värdefull information om inställningarna för strömförsörjningen och provvandringens hastighet.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online