Så genomför du en FRET-analys – komplett steg-för-steg-guide

Fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) är en analytisk teknik som används för att mäta förekomsten och omfattningen av bindning mellan två proteiner som är kopplade till reportermolekyler. Metoden används ofta för att undersöka potentiellt interagerande proteiner i olika celltyper samt för att utvärdera effektiviteten hos konjugerande enzymer.

Den utrustning som krävs beror till stor del på vilka reportermolekyler som väljs, men i många fall räcker en enkel 96-brunnsplattläsare för att genomföra hela analysen.

Det här behöver du

• Fusionskonstrukter med reportermolekyler för vart och ett av de proteiner som ska testas
• 96-brunnsplatta
• 96-brunnsplattläsare
• Reaktionsbuffert (vanligtvis Tris- eller fosfatbuffrerad saltlösning)
• Konjugationsenzym (vid behov)

Instruktioner

Uppställning och avläsning

1. Generera eller förbered fusionskonstrukter av varje protein av intresse, där varje protein är kopplat till en fluorescerande molekyl, till exempel grönt fluorescerande protein (GFP), rodamin eller boron-dipyrrometen (BODIPY).

2. Bestäm absorptions- och emissionsvåglängder för varje fluorescerande komponent och för analysen som helhet. Om analysen exempelvis mäter energiöverföring från GFP till rodamin är excitationsvåglängden densamma som GFP:s absorptionsmaximum (488 nm), medan detektionsvåglängden motsvarar rodaminets emissionsmaximum (595 nm).

3. Skapa en lämplig reaktionsbuffert utifrån de biokemiska egenskaperna hos proteinerna av intresse. En Tris-baserad buffert är vanlig, ofta med tillsats av kalciumklorid och 0,05 procent Tween-20. Exakta koncentrationer och komponenter kan fastställas genom att söka efter vetenskapliga artiklar som beskriver liknande reaktioner och betingelser.

4. Blanda de två reporter-märkta proteinerna i olika koncentrationer i reaktionsbufferten och dosera 50–200 µl per brunn. Tillsätt vid behov ett konjugationsenzym (till exempel sortas) till varje provbrunn.

   Vid en slutpunktsanalys: låt provet inkubera i rumstemperatur (eller enzymets optimala temperatur) under en bestämd tid innan plattan läses av. Vid en kinetikanalys går du direkt vidare till avläsning (se nästa steg).

5. Läs av och analysera resultaten:

   • Sätt in provplattan i 96-brunnsplattläsaren.
   • Skapa en ny experimentsida och öppna inställningsmenyn.
   • Ange korrekt absorptions- (excitations-) och emissionsvåglängd och välj sedan vilka brunnar som ska läsas av.
   • Vid kinetikexperiment: ställ in experimentets tidsförlopp och avläsningsintervall, till exempel en mätning var tionde minut.
   • Starta avläsningen av proverna.
   • Analysera data med Microsoft Excels diagramfunktion eller ett annat program för grafisk bearbetning, som GraphPad.

Tips för bättre resultat

Inkludera alltid kontroller i din platta: en brunn med endast donatorprotein (utan acceptor) och en med endast acceptorprotein. Detta gör det möjligt att korrigera för bakgrundsfluorescens och direkt excitation av acceptorn, vilket ger en mer tillförlitlig mätning av den faktiska energioverföringen mellan proteinerna.