Hur man genomför en FRET -analys

Fluorescensresonansenergiöverföring ( FRET) är en analysteknik som används för att mäta förekomsten och mängden bindning mellan två reporterbundnaproteiner. Denna analys används ofta för att analysera potentiellt bindande proteiner i olika typer av celler , och för att mäta effektiviteten av konjugering -typ enzymer . Utrustningen detektering behövs beror i hög grad på vilka typer av reportermolekyler som används , även om många gånger en enkel 96 -brunnsplattläsarekan användas. Saker du behöver
Protein-of-interest/Reporter molekyl konstruerar för varje protein som testas
96 -brunnar blockera
96 -brunnsplattläsare
reaktionsbuffert (i allmänhet Tris- eller fosfat - buffrad koksaltbaserad) katalog Konjugering enzym ( om nödvändigt)
Visa fler instruktioner
Start och läsa
en

Generera eller bereda fusionskonstruktioner för varje protein av intresse , med var och en är kopplad till en fluorescensutsändningsmolekyl, såsom grönfluorescerande protein (GFP) , rodamin eller bor- dipyrromethene ( BODIPY ) .
2

Bestäm absorbansenheter och emissionsvåglängder för varje fluorescerande komponenten och av den totala analysen. ( Till exempel, om den analys mäter GFP -> Rhodamine fluorescensenergiöverföring , är ingångs absorbansvåglängden som av GFP : s absorbansen ( 488 nm) , och detekteringsemissionsvåglängdenär att för rodamin ( 595 nm) ) katalog .
3

Skapa lämplig reaktionsbuffert för experimentet , beroende på vilka proteiner intressanta biokemiska egenskaper. En TRIS - baserad buffert används ofta , bland annat kalciumklorid och 0,05 procent Tween - 20 . Specifika koncentrationer och komponenterna kan bestämmas genom att söka efter journalposter detailing liknande reaktioner och betingelser.
4

Blanda två reporter -konjugerade proteiner av intresse i olika koncentrationer i reaktionsbuffert, och alikvoten 50-200 ul per brunn. Lägg till en konjugering enzym ( t.ex. sortase ) till varje prov väl om det är lämpligt . Om du utför en slutpunktenanalys , tillåta inkubation vid rumstemperatur ( eller enzymets optimala temperatur ) under en bestämd tid , sedan läsa på 96 -brunnar läsare . Om du utför en kinetik analys , gå direkt till behandlingen ( se nedan ) .
5

Sätt i provplattai 96 -brunnar läsare . Skapa ett nytt experiment och få tillgång till inställningsmenyn . Mata in rätt absorbansen ( excitation ) och emissionsvåglängder , välj sedan lämpliga brunnar som ska läsas .
P Om du utför en kinetik experiment , ställa in tid - experimentets och avläsningar intervallperiod( t.ex. en gång per 10 minuter ) .

Börja läsa prov .

Analysera data med hjälp av Microsoft Excel s graffunktion( eller annat grafer program som GraphPad ) . Addera