MBP (maltose binding protein), eller maltosbindande protein på svenska, är ett protein som förekommer i bakterien Escherichia coli, en art som ingår i tarmfloran hos både människor och djur. Proteinets naturliga uppgift är att binda maltos och transportera sockret in i bakteriecellen.
Inom molekylärbiologin används MBP ofta som fusionsmarkör, eftersom det ökar lösligheten hos rekombinanta proteiner och underlättar deras rening. Reningen av MBP innefattar en serie procedurer som syftar till att separera proteinets beståndsdelar från övriga cellkomponenter. Processen är avgörande för studier av proteinets struktur och funktion. De vanligaste MBP-reningsprotokollen omfattar rening av MBP-fusionsproteiner, småskalig MBP-fusion samt rening med hjälp av maltosbindande protein som fusionsmarkör.
Under detta protokoll tvättar laboratorietekniker 20 ml av polymeren amylosharts med en Tris-lösning (pH 7,4) innehållande natriumklorid, merkaptioetanol (ME) och etylendiamintetraättiksyra (EDTA), enligt Protocols Online. Amylos har en hög affinitet för MBP, vilket gör att fusionsproteinet binder selektivt till hartset. Därefter tillsätts cellprover, som centrifugeras och analyseras med gelelektrofores. Proverna analyseras även i en kromatograf, där teknikerna eluerar och observerar lösningens beståndsdelar allteftersom de passerar genom kromatografikolonnen.
Enligt Hebreiska universitetet i Jerusalem använder forskare reagenset isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) för att inducera proteinexpression. Cellkulturen centrifugeras därefter i 10 minuter vid 8 000 varv per minut och en temperatur på cirka 4 °C (39,2 °F).
I nästa steg avlägsnas överständet och kall PBS-buffer blandas med provet, som delas upp i flera rör och centrifugeras igen. Proverna förvaras sedan vid omkring −80 °C (−112 °F) tills den fortsatta analysen genomförs.
Affinitetsmarkörer är genetiskt konstruerade molekyler som används inom molekylärbiologin för att detektera och rena proteiner. Detta protokoll är en komplex uppsättning procedurer som delas in i tre steg: konstruktion av polyhistidin-proteinmarkören (HisMBP), ett pilotexperiment för att bedöma proteinets löslighet samt storskalig rening av MBP-molekyler, enligt Nature Protocols.
Utöver E. coli-prover krävs ett antal reagenser och material, bland annat ampicillin, kanamycin, IPTG, anhydrotetracyklin, glukosmonohydrat, celllyseringsbuffer, DNA-polymeras, PCR-primers, Tris-acetat-EDTA och etidiumbromid.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online