Cellbaserade ELISA-protokoll: steg-för-steg-guide

Vad är ELISA?

Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) är en hörnstensteknik inom både klinisk diagnostik och biologisk forskning för att kvantifiera specifika proteiner. Genom att utnyttja antikroppars höga specificitet tillsammans med en kolorimetrisk eller kemiluminescerande avläsning omvandlar metoden proteinmängd till ett mätbart signalvärde. Cellbaserade ELISA-protokoll gör det dessutom möjligt att analysera proteiner direkt i sitt naturliga cellulära sammanhang.

Steg 1: Cellodling

Så celler i brunnarna på en 96-brunnsplatta med en densitet som ger 100 µl odlingsmedium per brunn. Låt cellerna fästa över natten. I studier där cellulära svar på externa stimuli undersöks bör cellerna serumsvältas i 24 timmar innan den aktuella faktorn tillsätts, eftersom detta minskar bakgrundssignalen och ökar känsligheten i analysen.

Steg 2: Fixering och primärantikropp

Ta bort odlingsmediet och fixera cellerna med 3 % formaldehyd eller metanol. För att ge antikroppar tillgång till cellens inre behöver membranet permeabiliseras med 0,1 % Triton X-100 – detta steg kan utelämnas om metanolfixering redan har utförts, eftersom metanol själv skapar porer i membranet. Blockera därefter icke-specifika bindningsställen med 10 % fostercalfserum utspätt i fosfatbuffrerad saltlösning (PBS). Efter blockeringen tillsätts primärantikroppen, som inkuberas i 60 minuter vid rumstemperatur.

Steg 3: Sekundärantikropp och detektion

Tvätta cellerna tre gånger med PBS och tillsätt sedan en sekundärantikropp konjugerad med horseradishperoxidas (HRP). Inkubera i 60 minuter, tvätta igen och tillsätt ett kemiluminescerande substrat. Det emitterade ljuset fångas upp med en plattläsare eller ett bildsystem, vilket ger ett kvantitativt mått på proteinnivåerna i varje brunn.

Praktiska tips för bättre resultat

För att uppnå reproducerbara resultat är det viktigt att hålla inkubationstider och temperaturer konsekventa genom hela protokollet. Använd gärna en multikanalpipett vid tvättstegen för att säkerställa likvärdig hantering av alla brunnar, och se till att brunnarna aldrig får torka ut mellan stegen. Kontrollera även att både primära och sekundära antikroppar är validerade för användning i cellbaserade analyser.