Felsökning av genotypning: guide till lyckade PCR-resultat

Genotypning används för att studera genetiska skillnader mellan celler med hjälp av provets DNA. Den vanligaste laboratoriemetoden för genotypning är PCR (polymeraskedjereaktion), en teknik som förstärker specifika DNA-sekvenser så att de blir möjliga att analysera. För att en PCR ska fungera krävs korta DNA-fragment som kallas primers.

Att ta fram egna primers är ofta nödvändigt, men det kan i sig bli en källa till fel. Även när primrarna väl är på plats kan experimentet ge otydliga eller missvisande resultat. Med rätt felsökningsmetoder går det dock oftast att hitta orsaken och få fram tillförlitliga data. Här följer en strukturerad guide för att felsöka din genotypning med PCR.

Det här behöver du

• PCR-kit
• Tillgång till laboratorium
• Laborationshandskar
• Pipetter
• Destillerat vatten

Så felsöker du din genotypning

1. Rengör allt noggrant. Tvätta och sterilisera pipetterna och all annan utrustning. Städa arbetsytan ordentligt och använd alltid lämpliga handskar under experimentet – kontaminering är en av de vanligaste orsakerna till misslyckade PCR-resultat.

2. Kör en negativ kontroll. Genomför en PCR-reaktion helt utan DNA. Syns band även här har något kontaminerats, eftersom inget DNA borde kunna förstärkas.

3. Kör en positiv kontroll om möjligt. Använd ett prov med känd DNA-sekvens som passar just ditt test. Visar den positiva kontrollen inget resultat ligger problemet troligen i reaktionsblandningen eller programmet snarare än i provet.

4. Testa flera koncentrationer. Förbered en serie utspädningar av ditt DNA-prov, till exempel med destillerat vatten. Att köra flera utspädningar visar vilken koncentration som ger bäst förstärkning av DNA:t.

5. Kör separata reaktioner per primer. Har du problem med PCR-produkten bör du köra en egen PCR-reaktion för varje primer i stället för att kombinera dem. Då ser du direkt om någon enskild primer presterar sämre.

6. Justera temperaturen. Om banden inte förstärks kan annehlingstemperaturen vara fel. Prova att höja eller sänka temperaturen stegvis – en för hög temperatur hindrar primrarna från att binda, medan en för låg ger ospecifik bindning.

7. Beställ nya primers. Det kan finnas något fel på dina nuvarande primers, exempelvis nedbrytning eller ett fel vid syntesen, och ibland räcker det helt enkelt med en ny sats.

8. Välj en annan primer. Fungerar fortfarande inte experimentet trots nya primers bör du byta till en alternativ primersekvens. Studera den primära forskningslitteraturen från studier som använt samma organism eller provtyp, och se hur de designat sina primers.

9. Rena ditt DNA på nytt. Har alla andra åtgärder misslyckats kan provet innehålla ämnen som hämmar reaktionen. Rena DNA:t igen, till exempel genom extraktion med natriumhydroxid, innan du gör ett nytt försök.

Med systematisk felsökning – från god hygien och korrekta kontroller till utspädningar, temperaturjusteringar och alternativa primers – ökar du chansen betydligt att få tydliga och tillförlitliga resultat i din genotypningsanalys.