Hur man kalibrerar en HPLC – steg för steg

HPLC (high-performance liquid chromatography), på svenska ofta kallad högtrycksvätskekromatografi, är en analysmetod där lösningsmedel pressas genom en kolonn under mycket högt tryck – upp till 400 atmosfärer. Det höga trycket gör att analysen går betydligt snabbare än vid många andra kromatografimetoder, och HPLC-apparatens detektionssystem är både automatiserat och känsligt.

Innan du kan utföra en HPLC-analys måste du förbereda en serie kalibreringsstandarder som innehåller de ämnen du vill mäta, och utifrån dessa upprätta en kalibreringskurva. Nedan följer en guide som tar dig genom processen steg för steg.

Det här behöver du

• HPLC-kolonn
• Prover
• HPLC-vatten
• Standarder för proverna
• Mätkolvar
• Microsoft Word eller Excel

Instruktioner

1. Förbered en serie utspädningar för att ta fram kalibreringsstandarder som innehåller de föreningar som ska analyseras. Gör standarderna i intervallet 20 mikrogram per milliliter upp till 100 mikrogram per milliliter med hjälp av mätkolvar. Använd alltid HPLC-kvalitetsvatten för dina utspädningar. Analyserar du exempelvis koffein skaffar du en kaffeinstandard och späder ut den i olika koncentrationer för att skapa en standardkurva.

2. Förbered det prov du vill analysera i HPLC:n. Vill du till exempel mäta koffeinhalt kan du använda te eller kaffe som provmaterial.

3. Späd ut provet med HPLC-kvalitetsvatten så att dess koncentration hamnar inom samma intervall som dina standarder. Annars blir det svårt att läsa av ett korrekt värde från kalibreringskurvan.

4. Injicera proverna i HPLC-kolonnen. Följ noga de specifika instruktioner som kolonntillverkaren anger för just din kolonn, eftersom injektionsvolym och flödeshastighet kan variera mellan olika modeller.

5. Rita ett diagram över de data du fått för dina standardlösningar, med topparea på en axel och provkoncentrationen på den andra. Det går enkelt att göra i Excel, som dessutom kan räkna fram en regressionslinje åt dig.

6. Använd den standardkurva du skapat för att bestämma koncentrationen av varje komponent i ditt prov. Jämför provets topparea med kurvan så får du fram motsvarande koncentration.

Tips för ett exakt resultat

För att få ett så tillförlitligt resultat som möjligt bör din kalibreringskurva vara linjär över hela koncentrationsintervallet. Kontrollera att standarderna ger jämnt fördelade punkter i diagrammet och använd gärna Excels funktion för linjär regression för att beräkna ett R²-värde. Ett värde nära 1 visar att kurvan har god kvalitet och kan användas för att bestämma okända koncentrationer med hög noggrannhet.