Genomiskt DNA utgör den ritning som celler följer för att organiseras till levande organismer. DNA innehåller fyra återkommande kvävebaser: adenin, guanin, cytosin och tymin. Forskare har framgångsrikt fastställt hela bassekvensen – genomet – för många komplexa organismer, inklusive människan.
Det finns flera viktiga skäl att sekvensera ett genom. Inom medicinsk genetik söker man genetiska avvikelser som orsakar sjukdomar som diabetes, Alzheimers sjukdom och cancer. Evolutionsgenetiker jämför å sin sida genom från besläktade arter för att bygga upp en korrekt taxonomi. Oavsett syfte med forskningen är de grundläggande genetiska protokollen desamma.
Genetisk forskning kräver extraktion av ett rent DNA-prov från celler. Ett grundläggande protokoll börjar med att bryta ned och avlägsna skyddande växtcellväggar eller djurcellsmembran med hjälp av enzymet lysozym. Icke-genetiska cellkomponenter i form av precipitat avlägsnas genom snabb centrifugering, medan DNA stannar kvar i lösningen.
Därefter fälls DNA ut i närvaro av natriumacetatsalt och etanol. En avslutande centrifugering fäller ut och packar ihop det rena genetiska materialet i en pellet, redo att användas i forskningen.
Genetisk forskning kräver tillräckligt många kopior av specifika DNA-regioner. Polymeraskedjereaktionen, PCR, är en metod för att exponentiellt framställa kopior av DNA. Protokollet kräver renat DNA, Taq-polymeras, byggstenar kallade deoxynukleotider samt korta DNA-strängar som primerar det aktuella området.
Reaktionsblandningen placeras i en termocykler, en apparat som klarar snabba temperaturväxlingar. Upphettning till 95 grader Celsius separerar det dubbelsträngade DNA:t, varefter temperaturen sänks till 48 grader så att primrarna kan fästa, eller anneala, till matchande baser. Temperaturen höjs sedan till 72 grader, varvid Taq-polymeraset bygger ihop deoxynukleotiderna till en ny kopia av DNA:t – ett steg som kallas förlängning (extension).
Automatiserad sekvensering används för att fastställa den exakta bassekvensen och för att jämföra normalt DNA med onormalt DNA. Protokollet innebär att fluorescensmärkta dideoxynukleotider, ddNTP, tillsätts till vanliga PCR-reaktioner, vilket slumpmässigt stoppar förlängningen av DNA-fragmenten. Resultatet blir DNA-fragment som skiljer sig åt med en enda bas, där varje bastyp har en egen färg.
Slutprodukterna laddas på en automatiserad sekvenserare, en instrument som separerar fragmenten efter storlek på en polymer med hjälp av elektrisk ström. När fragmenten når polymerens slutpunkt registrerar en digitalkamera basens färg och skickar data till en dator för analys.
Sekvenseringsdata visas som färgade band som representerar DNA-baser.
Genotypning är en metod som jämför små segment av ett genom mellan olika organismer. Målet är att upptäcka små skillnader i PCR-fragmentens storlek, vilka beror på naturliga eller tillfälliga basförändringar i DNA:t. Protokollet utgår från grundläggande PCR med en fluorescensmärkt primer för detektering på automatiserade sekvenserare. De märkta produkterna separeras efter storlek och registreras av en digitalkamera till en dator för analys.
Genotypningsprotokoll används bland annat för rättsmedicinsk identifiering, DNA-fingeravtryck och faderskapstest, samt för att identifiera genetiska avvikelser som leder till sjukdom.
DNA-fingeravtryck används exempelvis för att identifiera mänskliga kvarlevor.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online