Genetisk forskning är en av de snabbast växande vetenskapliga disciplinerna idag. Den tidiga tekniken började med metoder som använde radioaktiva markörer för DNA-sekvensering – alltså identifiering av de enskilda baser som bygger upp DNA.
DNA är ritningen bakom alla levande organismer, inklusive virus. Det består av miljontals eller miljardtals upprepade enheter av fyra kvävebaser, betecknade A för adenin, G för guanin, C för cytosin och T för tymin. Människan innehåller cirka 9 miljarder av dessa baser, upprepade utan något tydligt mönster. Tre baser tillsammans symboliserar en aminosyra, och en kedja av aminosyror bildar ett protein. Kombinationen av olika proteiner avgör egenskaperna hos en levande organism – det som kallas fenotyp.
DNA-analystekniker används för att bestämma DNA-sekvenser, dels för att förstå hur levande organismer utvecklas, dels för att hitta de fel i sekvensen som orsakar sjukdomar som cancer. Tekniken tog enorma steg framåt efter att PCR introducerades 1985.
Polymeraskedjereaktionen, eller PCR, är kanske det viktigaste genombrottet inom genetisk forskning. Kary Mullis uppfann PCR 1985. Metoden gör det möjligt för forskare att förstärka specifika områden av DNA och producera miljontals kopior inom bara några timmar. PCR använder ett värmestabilt enzym som kallas Taq-polymeras, isolerat från bakterien Thermus aquaticus, som lever i heta källor. I närvaro av råmaterial syntetiserar Taq-polymeras kopior av DNA med originalet som mall. Forskare styr exakt vilket DNA-område som ska förstärkas genom att tillsätta korta DNA-strängar på cirka 20 baser, så kallade primers. Primers initierar förstärkningen genom att para sig, eller anneala, till en matchande sekvens på DNA-mallen. Samtliga tekniker som utvecklats sedan 1985 bygger i någon form på PCR-förstärkning.
DNA-sekvensering bestämmer den exakta ordningen på kvävebaserna. I de tidiga metoderna märktes varje bas med en radioaktiv markör under PCR. Det förstärkta DNA:t separerades sedan med elektrisk ström och vandrade genom ett geléliknande material kallat polyakrylamid. Tekniken hade dock en viktig begränsning: eftersom radioaktiva markörer ser identiska ut vid avläsning med röntgenfilm måste varje bastyp analyseras i en egen bana på gelen. Utvecklingen av fluorescerande färgämnen automatiserade tekniken i början av 1990-talet, och varje bas fick då sin egen färg. När baserna vandrade genom gelen registrerade en digitalkamera färgerna och skickade data direkt till en ansluten dator. Automatiserad sekvensering gjorde det möjligt att läsa upp till 700 baser per analys, jämfört med tidigare max 200 baser med radioaktiva markörer.
Runt 1997 utvecklades DNA-sekvenseringen ytterligare när de kladdiga glasplattorna och polyakrylamidgelen ersattes med glaskapillärer. Forskarna behövde inte längre hälla akrylamid mellan två glasplattor och vänta på att gelen skulle stelna innan analysen kunde börja. Sekvenseringen utfördes istället i en tjock, sirapsliknande polymer baserad på polyakrylamid, som injicerades i ihåliga glasfiber. Proverna förstärks fortfarande med PCR och fluorescerande färgämnen, men laddas nu automatiskt in i individuella kapillärer för sekvensering. Resultatet blev betydligt mer automatiserade arbetsflöden och möjligheten att analysera många fler prover på kortare tid. Större delen av det mänskliga genomet – alla 9 miljarder baser – kartlades med hjälp av kapillärsekvensering.
Efter att DNA-sekvensen för en specifik organism fastställts blev nästa forskningsmål att söka efter variationer mellan organismer av samma och olika arter. Ett skäl är att analysera skillnader och likheter i DNA-sekvens mellan olika arter – varför människan är människa och gorillan inte är det. Ett annat skäl är att använda genetiska metoder för att identifiera fel, eller mutationer, som orsakar genetiska sjukdomar. Realtids-PCR bygger på samma principer som vanlig PCR, men kompletteras med en extra fluorescerande märkt primer som markerar en specifik sekvens. Om det finns ett fel i DNA:t hindras markören från att anneala till DNA-strängen. Genom att mäta markörens förmåga att binda under PCR-cykeln kan forskaren avgöra om en mutation finns.
Mikrochiparrayanalys utvecklades kort efter realtids-PCR och används främst för att studera genuttryck, det vill säga vilka gener i en cell som är aktiva. Inte alla gener i genomet är aktiva samtidigt. Aktiveringen av specifika gener avgör funktionen hos olika celltyper i komplexa organismer – det är därför en hudcell inte är en levercell. Forskare isolerar produkten av aktiva gener i form av budbärar-RNA (mRNA) och använder PCR-teknik för att skapa ett komplementärt DNA. Prov-DNA:t placeras på en platta med märkta prober som fluorescerar i närvaro av matchande DNA. Dagens plattor kan analysera över 30 000 prover samtidigt.
Den senaste utvecklingen inom DNA-analys är sekvenserare av nästa generation (next generation sequencing). Processen liknar vanlig sekvensering, men utrustningen klarar av att bestämma hela genomsekvenser från exempelvis bakterier – upp till 2 miljoner baser åt gången. Metoden bygger på emulsions-PCR, en teknik där DNA inkapslas på mikropärlor eller i oljedroppar. Detta ökar effektiviteten i PCR-processen dramatiskt och gör det möjligt att förstärka flera DNA-regioner parallellt. Det förstärkta DNA:t sekvenseras därefter med specialiserade instrument. Tack vare denna tekniska utveckling har genetiken blivit ett av de mest dynamiska och snabbväxande områdena inom modern vetenskap.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online