Visualisering av nukleinsyror eller proteiner är avgörande när du utför agarosgelelektrofores. Arbetar du utan att färga gelen kan du inte se vart provet har vandrat, vilket kraftigt begränsar exempelvis mätningar av molekylstorlek. Färga därför gelen med ett vanligt och välbeprövat färgämne, såsom etidiumbromid (EtBr), som fluorescerar under ultraviolett (UV) ljus när det interkalerat i DNA- eller RNA-molekyler. Färgämnet hjälper dig genom experimentet genom att visa molekylerna i provet som tydliga markeringar.
OBS: Etidiumbromid är en känd mutagen och ska alltid hanteras med lämplig skyddsutrustning och enligt laboratoriets säkerhetsrutiner.
Använd tunna men skyddande handskar som ger dina fingrar och händer full rörelsefrihet. Ta med en liten pipett upp en viss mängd EtBr (eller motsvarande färgämne) ur behållaren.
Tillsätt 0,5 mikrogram per milliliter av din valda färg till provet. Täck över provet och blanda manuellt – några skakningar räcker oftast.
Tillsätt en negativt laddad laddningsbuffert till blandningen med hjälp av pipetten. Detta gör att det färgade provet blir synligt för blotta ögat i naturligt ljus och eliminerar behovet av dyr och skadlig UV-strålning, som annars skulle kunna bryta ner de molekyler du studerar. Xylencyanol är en vanligt förekommande laddningsbuffert, men flera alternativ finns. Se till att välja en buffert som vandrar i samma hastighet som den molekyl du mäter – xylencyanol vandrar exempelvis i samma takt som DNA-fragment som är 5 000 baspar (bp) långa.
Använd en ren pipett för att applicera ditt preparerade prov i brunnarna i starten av agarosgelen. Vilken volym du applicerar beror på kammen storlek, alltså brunnarnas tjocklek och längd samt gelens tjocklek. Färga provet men inte kontrollen, så att du korrekt och effektivt kan bestämma de parametrar du är intresserad av, exempelvis molekylvikten.
Ett alternativ är att utföra Southern blotting för att visualisera provet. Då överför du DNA:t till ett nitrocellulosamembran och exponerar det för en hybridiseringsprob. Detta är tekniskt sett ingen färgning, men utgör ett lämpligt alternativ, enligt Access Excellence.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online