NBT, eller nitroblått tetrazolium, är en kemisk förening som används inom biokemi och immunologi för att detektera enzymet alkaliskt fosfatas. När enzymet är aktivt reduceras NBT till ett olösligt, mörklila färgämne som gör det möjligt att visualisera reaktionen. Ämnet används även vid diagnostik av kronisk granulomatosjukdom (chronic granulomatous disease), en sällsynt ärftlig sjukdom som försämrar de vita blodkropparnas förmåga att bekämpa infektioner.
De vanligaste protokollen för NBT-analyser omfattar immunoblotting, BCIP/NBT-substratlösning för alkaliskt fosfatas samt detektering av galaktosidas- och alkalisk fosfatasaktivitet i vävnadsprover.
Immunoblotting är en teknik som används för att detektera antikroppar – proteiner som spelar en central roll i immunförsvaret – förklarar Susan R. Haynes i boken "RNA-Protein Interaction Protocols". Metoden innefattar användning av NBT tillsammans med flera andra reagens, bland annat bovint serumalbumin, primära antikroppar av typen 9E10, Coomassie-färglösning, nitrocellulosamembran, Tris-basbuffertlösning, ammoniumpersulfat, natriumdodecylsulfat och vattenmättad butanol.
Genom att kombinera dessa komponenter kan forskarna separera, överföra och visuellt identifiera specifika proteiner i ett prov, vilket gör immunoblotting till en grundpelare inom molekylärbiologisk forskning.
Enligt webbplatsen IHC World bereder laboratorietekniker substratlösningen genom att blanda tre droppar 1-procentig 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP) med tre droppar 1,5-procentigt NBT, två droppar av ämnet levamisol samt buffert för alkaliskt fosfatas (AP-buffer) med pH-värdet 9,5. Lösningen inkuberas därefter i rumstemperatur och är sedan redo att användas.
Kombinationen BCIP/NBT är särskilt effektiv eftersom den ger en stabil, färgad utfällning vid platsen för enzymatisk aktivitet, vilket ger tydliga och lättavlästa resultat.
Galaktosidaser är enzymer som kan bryta ned galaktosidmolekylen, som finns hos bakterien Escherichia coli och i många andra organismer. Enligt Protocol Online använder biologer i detta protokoll cellprover från rätta som har behandlats med PBS-lösning, glutaraldehyd och paraformaldehyd.
Därefter bereds en reaktionsbuffert baserad på brom-klor-indolyl-galaktopyranosid (X-gal) för proverna. Bufferten innehåller kaliumferrocyanid, magnesiumklorid, natriumdeoxykolat samt detergensen Nonidet P-40. Som ett snabbare alternativ kan teknikerna ersätta kaliumferrocyaniden med nitroblått tetrazolium (NBT). Cellproverna analyseras slutligen under mikroskop, där färgreaktionerna avslöjar var enzymaktiviteten finns i vävnaden.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online