Western Blotting-protokoll – steg för steg mot tillförlitliga resultat

Western blot är en typ av proteinklottning som används dagligen inom medicin, biologiska laboratorier och andra vetenskapliga discipliner. När metoden utförs korrekt är western blot ett kraftfullt verktyg för att studera proteinexpression i vävnadsprov. Eftersom parametrarna kan variera mellan olika prov finns det ett antal protokoll som bör följas noggrant för att uppnå exakta och reproducerbara resultat.

Utför tvättningar

Efter att membranet har inkuberats i antikroppslösningarna under lämplig tid – vilket varierar beroende på vilken antikroppslösning som används – bör membranet enligt EnCor Biotechnology tvättas tre gånger i TBS vid rumstemperatur. TBS (Tris-buffered saline) är en lösning med specifik sammansättning och pH-värde som är avsedd just för tvättning. Kom ihåg att membranet alltid ska tvättas mellan varje tillförsel av ny antikroppslösning för att undvika oönskade reaktioner och bakgrundsbrus.

Förbereda färgningsblandningen

Enligt WesternBlotting.org uppnås de bästa resultaten om färgningsblandningen förbereds omedelbart innan den appliceras på membranet. Det finns flera olika typer av färgningslösningar – vissa kan köpas färdiga medan andra måste blandas i laboratoriet. Kemiluminescensfärgning ger enligt EnCor Biotechnology mest information per färgning, men är samtidigt den dyraste metoden och kräver mörkrum för framkallning. Horseradishperoxidas-färgning (HRP) och alkaliskt fosfatas-blotting är två vanliga alternativ. Oavsett vilken metod du väljer är det avgörande att blandningen prepareras strax före användning, eftersom flera av reagenserna är instabila över tid.

Använda buffert

Efter applicering av den valda färgningslösningen är användning av rätt buffert avgörande för resultatet. Vid kemiluminescensfärgning ingår det enligt WesternBlotting.org i protokollet att lägga en acetatfilm överst på färgningslösningen. Horseradishperoxidas-färgning kräver en ammoniumacetatbuffert för att erhålla den karakteristiska bruna färgprodukten. Bufferten som används vid alkaliskt fosfatas-blotting – som ska ge en lila färgprodukt – är mer komplicerad att framställa själv och kan därför med fördel köpas färdigblandad.

Genom att följa dessa grundläggande steg – noggranna tvättningar, färskt beredd färgningsblandning och korrekt buffertval – lägger du grunden för tydliga och tillförlitliga western blot-resultat i ditt laboratorium.