Så utför du en ELISA-analys – komplett steg-för-steg-guide

En ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) är en biokemisk laboratoriemetod som används för att detektera en antigen (till exempel ett protein) eller en antikropp i ett experimentellt prov. Metoden bygger på den specifika bindningen mellan antikropp och antigen och kan även användas för att studera andra cellbiologiska och molekylära bindningsmekanismer.

I en proteinbaserad ELISA-analys placeras en så kallad fångstantikropp (capture antibody) eller ett protein i en analysplatta, där den får fästa fast. Därefter tillsätts sonden (probe), till exempel proteinet man vill undersöka, som inkuberas med fångstagensen. Efter flera tvättsteg tillsätts en detektionsantikropp, vilket gör det möjligt att visualisera om antikropp–antigen- eller protein–protein-bindning förekommer eller inte.

Du behöver följande material

• Analysplatta (till exempel ett 96-brunnsblock)
• Fångstantikropp (utspädd till 5 µg/ml i 50 mM NaHCO₃, pH 9,6)
• Sondantikropp/protein (utspätt till olika koncentrationer)
• Detektionsantikropp (till exempel horseradishperoxidas-konjugerad antikropp)
• PT-buffer (1x PBS, 0,05 % Tween-20)
• Blockeringsbuffer (1x PBS med 5 mg/ml BSA, alternativt 5 % skummjölk i 1x PBS)
• Detektionsreagens (till exempel TMB-reagensblandning)
• Mekanisk labbskakare
• Kylrum eller kylskåp
• Pipetter och pipettspetsar

Så går analysen till – steg för steg

Steg 1: Belägg plattan med fångstantikropp

Späd fångstantikroppen till 5 µg/ml i 50 mM NaHCO₃ (pH 9,6). Tillsätt 50 µl i varje brunn på analysplattan. Täck plattan med plastfolie eller aluminiumfolie och inkubera över natten vid 4 °C på en skakare.

Steg 2: Tvätta och blockera

Häll av fångstantikroppslösningen och tvätta två gånger med 200 µl PT-buffer per brunn. Tillsätt därefter 200 µl blockeringsbuffer per brunn (1x PBS eller 5 % skummjölk). Inkubera mellan två timmar och över natten under skakning vid 4 °C.

Steg 3: Tillsätt sondprovet

Häll av blockeringsbufferten och tvätta fyra gånger med 200 µl PT-buffer. Tillsätt sondproteinet i olika koncentrationer, löst i PBS eller 5 % skummjölk – 100 µl per brunn. Inkubera i en timme under skakning vid 4 °C. Häll sedan av sondlösningarna och tvätta sex gånger med 200 µl PT-buffer.

Steg 4: Tillsätt detektionsantikropp

Tillsätt detektionsantikroppen (HRP-konjugerad antikropp) utspädd 1:4000 i PBS-buffer eller 5 % skummjölk, varav båda ska innehålla 0,05 % Tween-20. Använd 50 µl per provbrunn. Inkubera i 30 minuter till en timme under skakning vid 4 °C.

Steg 5: Utveckla reaktionen och avläs resultatet

Häll av detektionsantikroppslösningen och tvätta sex gånger med 200 µl PT-buffer per brunn, följt av två tvättar med 200 µl 1x PBS (fosfatbufferad saltlösning). Häll av PBS:n och tillsätt 100 µl detektionsreagens per brunn. För HRP används nyblandad TMB-reagens, framställd genom att blanda TMB-substrat och peroxid i förhållandet 1:1.

Inkubera i 15 minuter i rumstemperatur och skaka plattan då och då.

Vid användning av TMB och HRP: Avsluta reaktionen genom att tillsätta 100 µl 1M H₃PO₄ (fosforsyra) per brunn, vilket stoppar TMB-reaktionen.

Avläs slutligen plattan i en provanalysläsare, till exempel en 96-brunnsläsare. För HRP och TMB används vanligtvis mallen "ELISA End-Point Assay", som finns tillgänglig i de flesta plattläsare.