Så upptäcker du NADH – komplett guide med analysprotokoll

NADH (nikotinamid-adenin-dinukleotid), ofta förkortat "NAD", är ett koenzym som finns i levande celler och som driver kemiska reaktioner i proteiner. Läkemedelsföretag studerar NADH på grund av dess roll i metabolismen och framställer det syntetiskt för en rad olika ändamål. Eftersom NADH är mikroskopiskt kan det inte ses med blotta ögat – för att påvisa dess närvaro krävs vetenskapliga tester och en analyskit.

Detta behöver du

• Torris
• Mikrocentrifug
• Eppendorfrör

Instruktioner

Rekonstitution av reagens

1. Ställ cykleringsbufferten på en bänk och låt den nå rumstemperatur. Den ideala temperaturen för bufferten är 22 grader Celsius.

2. Rekonstituera NAD-cykleringsenzymblandningen med exakt 220 mikroliter cykleringsbuffert. Frys sedan lösningen vid temperaturer under -70 grader Celsius.

3. Rekonstituera NADH-utvecklaren med 1,2 ml ddH2O (avjoniserat vatten). Blanda försiktigt tills allt är helt upplöst – använd inte vortex.

4. Rekonstituera NADH-standarden med 200 mikroliter rent dimetylsulfoxid (DMSO).

Förberedelse av prov

5. Tvätta cellerna med fosfatbuffrerad saltlösning (PBS).

6. Pelletiera 2×10⁵ celler för varje enskild analys i ett mikrocentrifugrör och centrifugera vid 2 000 varv per minut i 5 minuter.

7. Extrahera cellerna med 400 mikroliter NAD/NADH-extraktionsbuffert genom att frysa och tina dem i två cykler – 20 minuter på torris följt av 10 minuter i rumstemperatur. Vortexta därefter de extraherade cellerna i exakt 10 sekunder.

8. Centrifugera cellproverna i mikrocentrifugen vid 14 000 varv per minut i exakt 5 minuter.

9. Överför NAD/NADH-cellerna till ett rent rör.

Analysprotokoll

10. Späd 10 mikroliter av NADH-standarden med 990 mikroliter NAD/NADH-extraktionsbuffert. Tillsätt 0, 2, 4, 6, 8 och 10 mikroliter av den spädda lösningen i en 96-brunnsplatta, i dublett, för att skapa standarder motsvarande 0, 20, 40, 60, 80 och 100. Fyll den sista brunnen med 50 mikroliter NAD/NADH-extraktionsbuffert.

11. Överför 50 mikroliter av de extraherade cellproverna till en 96-brunnsplatta i dubletter, på samma sätt som tidigare.

12. Förbered cellproverna för NADH-detektion. Sönderdela NAD i proverna genom att överföra 200 mikroliter av de extraherade cellproverna till eppendorfrör. Värm rören till 60 grader Celsius i exakt 30 minuter i ett temperaturreglerat vattenbad. Kyl snabbt proverna genom att placera rören på is. Centrifugera därefter proverna i mikrocentrifugen för att avlägsna precipitat. Överför slutligen 50 mikroliter av de sönderdelade proverna till en 96-brunnsplatta i dubletter.

13. Blanda NAD-cykleringsbuffertmixen genom att kombinera 100 mikroliter NAD-cykleringsbuffertmix med 2 mikroliter NAD-cykleringsenzym. Tillsätt 100 mikroliter av denna nya lösning i varje brunn med både NADH-standarder och prover.

14. Inkubera plattan i rumstemperatur i exakt 5 minuter. Denna process omvandlar NAD till NADH.

15. Tillsätt 10 mikroliter NADH-utvecklare i varje brunn. Låt plattan stå i rumstemperatur i minst 1 timme men högst 4 timmar.

16. Avläs plattan och beräkna NADH-koncentrationen.