Hur man upptäcker NADH

Nicotinamide adenin dinuceltoide ( NADH ) , förkortat " NAD " , är ett coenzym som finns i levande celler som producerar kemiska reaktioner i proteiner . Läkemedelsföretagen studera NADH grund av dess metabolism process , och syntetiskt skapa den för ett antal syften . Eftersom NADH är mikroskopisk , kan blotta ögat inte se det . Du behöver vetenskapliga tester och en analyssatsför att upptäcka dess närvaro . Detta är vad du behöver
Torris
Micro - centrifug
Eppendorf-rör
Visa fler Instruktioner
Reagensrekonstitution
1

Ställ cykelbuffertenpå en räknare och tillåter bufferten att nå rumstemperatur. Den idealiska temperaturen för bufferten är 22 grader Celsius .
2

Rekonstituera NAD cykling enzymblandningmed exakt 220 mikroliter cykling buffert . Frys lösningen i temperaturer under -70 grader Celsius . Addera 3

Rekonstituera NADH utvecklare med 1,2 ml ddH2O . Blanda försiktigt lösningen tills det är fullständigt upplöst. Inte virvel .
4

Bered NADH standard med 200 mikroliter ren dimetylsulfoxid .
Provberedning
5

Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning .
6

Pellet 2x10 ( 5 ) celler för varje enskild assay in i en mikro - centrifugrör och körs vid 2000 rpm under 5 minuter.
7

Extrahera cellerna med 400 mikroliter av NAD /NADH extraktionsbuffert genom frysning och tining av cellerna i två cykler - 20 minuter på torr is och 10 minuter vid rumstemperatur. Vortex den extraherade cellerna under exakt 10 sekunder.
8

Spin cellproverna i en mikro- centrifug vid 14.000 varv per minut under exakt 5 minuter.
9

Överför NAD /NADH- celler till ett rent rör . Addera Assay Protocol
10

Späd 10 mikroliter av den NADH- standard med 990 mikroliter NAD /NADH- extraktionsbuffert . Lägg 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 mikroliter av den utspädda lösningen i en 96 -brunnars platta i duplikat för att skapa 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 väl standard. Fyll den sista brunnen med 50 mikroliter av NAD /NADH- extraktionsbuffert .
11

Transfer 50 mikroliter av de extraherade cellprover i en 96 -brunnars platta i duplikat som tidigare.
12

Förbered cellprover för NADH detektering . Bryta ner NAD från cellprovergenom att sätta 200 mikroliter av de extraherade cellprover i Eppendorf-rör . Värm rören till 60 ° C i exakt 30 minuter i ett temperaturreglerat vattenbad. Snabbt kyla proverna genom att placera rören på is. Centrifugera proverna i mikro- centrifug för att avlägsna fällningar. Överför 50 ul av de nedbrutna prov till en 96 -brunnars platta i duplikat som tidigare.
13

Blanda NAD cykling buffertblandning med 100 mikroliter av NAD cykling buffertblandning och 2 mikroliter av NAD cykling enzym. Tillsätt 100 mikroliter av denna nya lösning i varje brunn i NADH standarder och prover.
14

Inkubera plattan vid rumstemperatur i exakt 5 minuter. Denna process kommer att konvertera NAD till NADH .
15

Tillsätt 10 mikroliter av NADH utvecklare i varje brunn . Låt plattan stå i rumstemperatur i minst 1 timme och upp till 4 timmar.
16

Läs plattan och beräkna NADH. Addera