Biotinyleringsprotokoll: Metoder för antikroppar, peptider och cellytor

Biotinylering är processen där biotin, även känt som vitamin H, kopplas till ett protein eller andra molekyler. Denna vetenskapliga metod används främst inom bioteknologi och molekylärbiologisk forskning som rör DNA, proteiner och antigener – det vill säga molekyler som kroppens immunsystem känner igen som inkräktare.

Vanliga biotinyleringsprotokoll omfattar biotinylering av antikroppar och peptider samt biotinylering av cellytor. Nedan följer en genomgång av de tre huvudsakliga metoderna.

Biotinylering av antikroppar

För att koppla biotin till antikroppar – proteiner som bildas när ett antigen tränger in i kroppen – använder laboratorietekniker natriumbikarbonat (NaHCO₃) vid pH 9, dimetylsulfoxid (DMSO), NHS-biotin samt en saltlösning som kallas PBS (fosfatbuffrad saltlösning).

Proverna blandas först med natriumbikarbonat, som därefter tillsätts NHS-biotin löst i DMSO. Lösningen adderas sedan till de antikroppar som ska analyseras och inkuberas på en rotationsapparat i fyra timmar vid rumstemperatur, alternativt över natten vid cirka 4 °C (39,2 °F). Slutligen späds lösningen ut med PBS innan vidare analys.

Biotinylering av cellytor

I protokollet för biotinylering av cellytor används vävnadskultur, fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH 7,4 samt en buffertlösning av sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)etyl-1,3-ditiopropionat för att balansera surhetsgraden. Bufferten innehåller aminogrupper och TrisCl, enligt Current Protocols in Protein Science.

Cellerna blandas med biotinlösningen och bufferten, varefter överståendet hälls av och provet centrifugeras. Det fasta materialet och specifika proteiner analyseras därefter med hjälp av gelelektrofores, vilket gör det möjligt att studera proteiner på cellytan.

Biotinylering av peptider

För biotinylering av peptider används reagenset NHS-SS-biotin, enligt Philip Shepherd i boken Monoclonal Antibodies: A Practical Approach. Peptider är korta kedjor av aminosyror – de byggstenar som utgör proteiner och DNA.

I detta protokoll löses den kommersiella lösningen NHS-SS-biotin först i vatten. Därefter tillsätts peptidprovet tillsammans med natriumbikarbonat för att stabilisera pH-värdet. Lösningen inkuberas sedan på is i två timmar. Efteråt kan teknikern studera provet både med och utan de bundna biotinmolekylerna för att utvärdera reaktionens resultat.