Vävnadskultur innebär att celler odlas i ett flytande näringsmedium i laboratoriemiljö för olika vetenskapliga ändamål. Vävnadskulturer används bland annat vid diagnos av genetiska sjukdomar, som medium för att odla intracellulära patogener som bakterier och virus, samt i studier av cellernas egen biologi.
Vissa celler fäster vid petriskålens botten, medan andra förblir fritt svävande i vätskan. Cellerna kan ha både växt- och djurursprung. I vävnadskultur används antingen primärceller – alltså celler som skördats direkt från en organism – eller cellinjer som underhållits i kultur under längre tid. Cellinjer härstammar ofta från cancerceller, något som alltid måste beaktas när experiment planeras och resultaten tolkas.
Adherenta celler avlägsnas från petriskålen inför passage antingen genom mekanisk skrapning eller med ett proteas, vanligen trypsin kombinerat med EDTA. Skrapning dödar dock många celler och bör endast användas när celllysater ska prepareras (flytande extrakt av cellinnehåll för analys) eller när trypsin/EDTA absolut måste undvikas.
Trypsinering avlägsnar inte bara de proteiner som fäster cellerna vid skålen, utan även de flesta andra proteiner på cellmembranet. Cellerna drar ihop sig till bollar och behöver därefter tid – oftast en hel natt – för att återfästa vid skålen.
Genom att tillsätta en minimal mängd trypsin – cirka 1 ml för en 25 cm²-kolv – gynja kolven i högst fem sekunder så att monolagret täcks, och sedan hälla av eller aspirera överskottet, minimeras den tid som cellerna exponeras för enzymet. Låt kolven vila i inkubatorn under trypsineringsprocessen.
När cellerna lossnat från skålens botten tillsätts medium med serum, och suspensionen pipetteras försiktigt upp och ner. Lämna lite medium kvar i skålen och pipetta upprepade gånger för att bryta upp klumpar och få en jämn cellfördelning.
Obs! Sug aldrig in bubblor i pipetten och blanda eller virvla aldrig cellsuspensionen kraftfullt – cellerna är mycket ömtåliga i sitt hoprullade tillstånd.
När cellodlingsteknikerna var i sin linda visste man att fetalt bovint serum (FBS) innehöll komplementproteiner – proteiner från immunsystemet som kan lysera celler. Komplement är oönskat i cellkultur. Värmeinaktivering av FBS vid 56 grader Celsius i 30 minuter gör komplementproteinerna overksamma. Även förvärmning av seruset till 37 °C räcker för att inaktivera komplementet.
På den tiden dödade värmebehandlingen dessutom mykoplasma och andra föroreningar. Då filtrerades serum genom 0,45 µm-filter. Idag filtersteriliseras FBS och medium genom 0,1 µm eller till och med 0,04 µm-filter – ingen mykoplasma passerar där igenom.
Frågan är alltså: behövs värmeinaktiveringen fortfarande?
Nackdelen är att värmeinaktivering bryter ner alla komponenter i FBS – vitaminer, aminosyror och tillväxtfaktorer – ibland under den nivå som krävs av känsliga cellinjer.
Arbetar du med en långsamväxande eller kräsen cellinje kan det vara klokt att enbart förlita sig på filtersterilisering. Många upplever att cellerna då blir friskare och mer robusta.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online