ELISA-testet, eller enzymkopplad immunosorbentanalys, är det vanligast förekommande kommersiella testet för att påvisa antikroppar i kroppsvätskor. Metoden används bland annat för screening av drogbruk, graviditet, hiv/aids och hepatit. Testets popularitet beror framför allt på att det är enkelt att utföra, kostnadseffektivt och ger tillförlitliga resultat.
Principen bakom ELISA bygger på att antikroppar binder specifikt till antigener. Genom att använda enzymer kopplade till antikroppar kan en färgreaktion visas när målantikroppen finns i provet. Färgändringen gör det möjligt att avläsa resultatet direkt i plattans brunnar.
Tillsätt ett känt antigen på ytan i flera av plattans brunnar. Täck därefter varje brunn med 50 mikroliter IgG-vätska. Låt brunnarna stå ostörda i minst fem minuter. Skölj sedan brunnarna med kranvatten och upprepa sköljningen fem gånger totalt. Knacka försiktigt plattan mot en pappershandduk för att torka den – torka aldrig av brunnarna direkt.
Tillsätt prover av kroppsvätska, så kallat serum, till plattorna. Dessa prover kan innehålla både konjugat och konkurrerande lösning, vilka binder till antigenet om de sökta antikropparna finns närvarande. Serumproverna måste spädas ut så att de effektivt kan binda till det antigen som applicerades i steg 1.
Tillsätt ett blockeringprotein, exempelvis kasein, till brunnarna. Detta hindrar andra proteiner än de som ska testas från att fastna på plattans ytor.
Tvätta plattan genom att hälla kranvatten försiktigt över brunnarna. Knacka därefter plattans sida mot en pappershandduk för att avlägsna överflödigt vatten. Upprepa tvättprocessen ytterligare fyra gånger utan att torka av brunnarna. Tillsätt sedan den antikropp som motsvarar den som ska påvisas.
Tvätta plattan igen på samma sätt: skölj försiktigt med kranvatten, knacka av överflödig vätska mot pappershandduk och upprepa fyra gånger till. Denna tvättning avlägsnar allt antigen som inte bundits, så att endast de antikropp–antigen-komplex som ska analyseras återstår i brunnarna. Tvätta slutligen plattan en gång till för att avlägsna alla obundna antikroppsenzymkonjugat.
Tillsätt sekundära antikroppar, även kallade anti-antikroppar, till brunnarna. Dessa fäster vid detektionsantikropparna. De sekundära antikropparna är konjugerade både med färgändringsindikatorn och med det antigen som tillsattes i steg 1.
Tvätta plattan enligt samma rutin: skölj med kranvatten, knacka av överskottsvätskan mot pappershandduk och upprepa fyra gånger till. Detta avlägsnar alla enzymkopplade antikroppar som inte bundit.
Applicera den enzymkopplade färgändringsindikatorn på plattan. Indikatorn gör att brunnar som innehåller de sökta antikropparna byter färg.
Observera plattans brunnar noggrant. En synlig färgändring visar att antikroppen finns i kroppsvätskeprovet, medan oförändrade brunnar tyder på att antikroppen saknas.
Tips: Använd alltid skyddsglasögon under hela proceduren och arbeta enligt laboratoriets säkerhetsrutiner, eftersom serumprover kan innehålla smittämnen.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online