Celler i odling är antingen suspensionsceller, såsom blodceller, eller vidhäftande celler, såsom fibroblaster, vilka kräver en yta att fästa mot. Beroende på celltyp och syfte med studien kan dessa ytor behöva beläggas med olika extracellulära matrix, exempelvis kollagen, fibronektin eller laminin. Oavsett celltyp måste all cellodling utföras under strikt aseptiska förhållanden, vanligtvis i ett laminärfluesskåp (biosafety cabinet), där arbetsytor desinficeras med 70-procentig etanol och material steriliseras innan användning.
De flesta celltyper kan odlas i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) eller Roswell Park Memorial Institute-medium (RPMI), med tillsats av 10 procent fetalt kalvserum, 2 millimol av aminosyran glutamin samt antibiotika – till exempel 100 enheter penicillin och 0,1 milligram per milliliter streptomycin. Cellerna hålls i sitt medium i en fuktighetsreglerad inkubator vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid. Kontrollera regelbundet att inkubatorns temperatur, gasnivåer och luftfuktighet ligger inom de angivna intervallen.
Cellerna bör inspekteras dagligen med mikroskop för att upptäckta tecken på infektion, celldöd eller onormal tillväxt. När odlingsflaskan är täckt till cirka 80 procent av cellerna (80 % konfluens) bör cellerna delas för att bevara deras hälsa och hålla dem i den logaritmiska tillväxtfasen. Arbetet utförs enligt följande:
Börja med att suga bort det gamla mediet och skölj cellerna försiktigt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna rester av serum. Vidhäftande celler kräver därefter tillsats av trypsin tillsammans med etylendiamintetraättiksyra (EDTA), vilket bryter ned de proteiner som gör att cellerna fäster vid ytan. Låt lösningen verka kort tid och använd sedan försiktig agitation för att lossa cellerna från flaskan. Avsluta med att tillsätta nytt medium, vilket neutraliserar trypsin-/EDTA-lösningen och skyddar cellerna från ytterligare enzymaktivitet.
Cell- och trypsin-/EDTA-lösningen kan centrifugeras för att pellettera och tvätta cellerna, vilket avlägsnar rester av trypsin. Därefter återuppsuspenderas cellerna i färskt medium, späds ut till önskad koncentration och överförs till nya odlingsflaskor. Varje gång cellerna delas ökas deras passagenummer med ett. Det är viktigt att dokumentera passagenumret, eftersom cellernas egenskaper kan förändras efter många passageomgångar.
Mediet bör bytas två gånger per vecka. Det görs genom att det gamla mediet avlägsnas och ersätts med nytt, förvärmt medium (cirka 37 grader Celsius). Uppvärmning av mediet före användning minskar risken för termisk stress hos cellerna och bidrar till stabil tillväxt och god cellhälsa över tid.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online