Biotinylering utnyttjar den lösliga vitaminen biotins förmåga att binda till cellproteiner. Eftersom biotin binder starkt till proteinet streptavidin är tekniken mycket användbar inom cellbiologin för att visualisera cellproteiner. Jämfört med metoder som bygger på radioaktivitet möjliggör biotinylering en säker märkning av proteiner utan att störa cellens normala funktion. Tekniken gör det möjligt för forskare att studera cellproteiner, exempelvis receptorer, vilket bidrar till en djupare förståelse av sjukdomar och sjukdomsprocesser.
Tvätta cellerna i iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna föroreningar. Observera att buffertar som innehåller tris eller glycin konkurrerar med biotinyleringsreaktionen och därför bör undvikas. För att förhindra att interna proteiner oönskat biotinyleras kan märkningen utföras vid 4 grader Celsius eller i närvaro av azid. Resuspendera därefter cellerna i PBS tillsammans med det lösliga biotinet sulfo-NHS-LC-biotin.
Tvätta cellerna i PBS och inkubera dem med en lämplig produkt, exempelvis sulfo-NHS-LC-biotin. Skrapa sedan ner cellerna i en petriskål och lysa dem i en buffert som innehåller detergenten Triton X-100. Provet är därefter klargjort för visualisering.
Efter inkubationen centrifugeras cellerna ner till ett pellet och tvättas i PBS. Cellerna resuspenderas i PBS och renas med hjälp av IgG-sefarosgel. Det bundna proteinet späds därefter i laddningsbuffert och hettas upp till 100 grader Celsius.
De utspädda proteinerna kan visualiseras med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), följt av blotting med protein- och enzymblandningen streptavidin-horseradishperoxidas. Blottarna visualiseras med hjälp av en kemisk reaktion – kemiluminescens – som avger ljus. Biotinyleringens specificitet kan bekräftas genom att använda antikroppar riktade mot det protein som studeras.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online