Lökar (Allium cepa) är ett välbeprövat verktyg inom miljötoxikologin. Genom att låta nybildade rötter växa i kontakt med ett ämne som ska testas – exempelvis avloppsvatten eller industriellt spillvatten – går det att avläsa ämnets effekter på levande celler. När exponeringstiden har passerat samlas rötterna in, fixeras, färgas och maceras, varefter cellernas kromosomer kan granskas i ett ljusmikroskop.
Testet visar toxicitet om kromosomavvikelser eller störningar i celldelningen upptäcks. Rottopparna används just därför att cellerna där växer och delar sig aktivt, vilket ger goda möjligheter att observera kromosomer i olika stadier av celldelningen.
Det här behöver du
- Lök
- Kniv
- Vatten
- Bägare eller andra behållare för vätskor och lökar
- Testvätskor
- Rakblad eller skalpell
- Små provflaskor
- Acetoalkoholfixativ
- Objektsglas
- Täckglas
- Saltsyra
- Macereringsstav i rostfritt stål
- Karbolfuksin
- Acetoorcein
- Ättiksyra
- Kanadabalsam
- Ljusmikroskop
- Kameraadapter för mikroskop
Så utför du testet steg för steg
Förberedelser
- Ta bort det yttre torra skalet från 12 lökar. Skrapa försiktigt lökens undersida runt rotplattorna utan att skada den yta varifrån rötterna ska växa fram.
- Välj bägare med tillräckligt bred mynning för att lökarnas undersidor ska kunna vila nedsänkta i vätskan. Fyll bägarna med destillerat vatten och placera en lök i varje bägare med basen i kontakt med vattnet. Klä bägarnas sidor med aluminiumfolie för att efterlikna mörkret under jorden. Byt vattnet dagligen.
- Kontrollera lökarna efter två dagar. Rötter bör då ha bildats. Bedöm rottillväxten och gallra bort de två lökar som visat sämst tillväxt.
- Uppställ en andra serie med fem bägare, vardera innehållande ett prov av det material som ska testas, till exempel avloppsvatten eller industriellt spillvatten. Placera fem av lökarna i dessa bägare och behåll de övriga fem i destillerat vatten som kontrollgrupp. Låt rötterna fortsätta växa i 24 timmar.
Förbereda rötterna
- Skörda fem till sex rottippar från varje lök med skalpell eller rakblad. Notera noggrant vilka prover som utgör kontroller och vilka som är testexponerade. Förvara rötterna från varje lök separat i små, märkta provflaskor.
- Fixera rottipporna omedelbart i acetoalkohol i förhållandet 1:3. Lägg rottipporna från en lök på ett objektsglas och macera dem i 1 M saltsyra vid 60 °C i tre minuter. Färga därefter de macerade tipparna med karbolfuksin – en blandning av fenol och basiskt fuksin som binder till beståndsdelar i cellväggarna och gör dem tydligare i ljusmikroskopet.
- Tillsätt 2-procentig acetoorcein i 4-procentig ättiksyra. Detta färgar kromosomerna. Rör om med macereringsstaven, lägg på ett täckglas och pressa ner det så att rottipporna plattas ut. Förslut antingen täckglaset med snabbtorkande nagellack eller montera preparatet permanent i kanadabalsam – ett harts från balsamgranen som blandas med eteriska oljor eller xylen. Numrera objektsglasen så att resultaten kan dokumenteras, utan att det syns om ett preparat är testexponerat eller kontroll.
Dokumentera resultaten
- Placera objektsglaset på ljusmikroskopets objektbord. Studera synfältet vid låg förstoring och växla sedan upp till högre förstoringar för att granska kromosomerna i detalj.
- Registrera alla kromosomavvikelser på ett datablad och koppla observationerna till respektive löks kodnummer. Notera bland annat ofullständigt separerade eller avbrutna kromosomer, mikrokärnor (extra kärnor som bildas mot slutet av celldelningen och kan innehålla kromosomfragment), kromosomringar samt klibbiga och störda kromosomer i olika delningsstadier. Fotografera varje preparat.
- Analysera materialet statistiskt och tolka resultaten för att avgöra om testlösningen är genotoxisk.
Sammanfattning
Metoden är enkel, billig och kräver ingen avancerad utrustning, vilket gjort Allium cepa-testet till en populär modell inom både miljöövervakning och undervisning. Resultaten ger dock endast en indikation – för definitiva slutsatser bör fynden kompletteras med ytterligare analyser och upprepade försök.
