Edmandegradation – en välkänd metod för att identifiera den N-terminala aminosyran i ett protein – bygger på att aminosyran först klyvs och sedan identifieras med hjälp av kromatografi eller elektrofores. Automatiserade processer har gjort N-terminal sekvensering betydligt snabbare och effektivare.
Proteiner som produceras inuti cellerna fungerar som hormoner, enzymer och andra viktiga regulatorer i kroppen. Genetiska mutationer som leder till onormala proteiner kan därför få allvarliga konsekvenser för hälsan. Att kunna fastställa en proteins exakta struktur, inklusive dess N-terminala aminosyra, är därmed avgörande inom biokemisk forskning och medicinsk diagnostik.
Vid Edmandegradation klyvs den N-terminala aminosyran genom behandling med specifika reagens och hydrolyseras därefter för att bilda en fristående aminosyra. Med hjälp av tunnskiktskromatografi, HPLC (vätskekromatografi med hög upplösning) eller elektrofores bestäms aminosyrans egenskaper och jämförs mot kända referensstandarder. Eftersom det återstående proteinet nu har en ny fri N-terminal ände kan proceduren upprepas stegvis, vilket gör det möjligt att kartlägga hela aminosyresekvensen bit för bit.
Företaget Applied Biosystems var ledande i utvecklingen av automatiserad Edmandegradation. I denna metod binds ett renat protein till ett membran och behandlas med fenylisotiocyanat. Den frigjorda aminosyran injiceras därefter automatiskt i ett HPLC-system för identifiering. Denna automatisering har avsevärt ökat hastigheten och noggrannheten vid sekvensering jämfört med manuella metoder.
För att den N-terminala aminosyran ska kunna bestämmas korrekt måste proteinproverna hållas relativt rena och fria från föroreningar. Metoden ställer även krav på provets storlek: större proteiner måste fragmenteras till mindre peptidkedjor om högst 50 aminosyror för att sekvenseringen ska ge tillförlitliga resultat.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online