Perfusionsteknik: Så fixerar du vävnad snabbt och jämnt

Vad är perfusionsteknik?

Perfusionstekniken ger snabb och jämn fixering av samtliga enskilda celler i en vävnad. Ett fixativ bestående av 4-procentig paraformaldehyd leds via kärlsystemet för att erhålla den vävnad som ska studeras. Med hjälp av tekniken kan man även identifiera huvudplatsen för läkemedelsadministrering i ett specifikt organ. Perfusion har dessutom hjälpt forskare att förstå den strukturella och funktionella organisationen av den mänskliga hjärnan.

Det här behöver du

• Djur (råtta eller apa)
• Perfusionspump och bägare
• Fixativ (4-procentig paraformaldehyd)
• Sprutnålar
• Perfusionsdroppset
• Sax
• Skalpell
• Pincett
• 0,9-procentig koksaltlösning
• Kylbox

Instruktioner

1. Bered fixativet

Bered färsk 4-procentig paraformaldehyd genom att blanda 40 g paraformaldehyd i 800 ml vatten. Värm lösningen till 60 °C under omrörning och kyl därefter ner den till 4 °C. Justera pH till 9,5 med hjälp av en pH-meter. Tillsätt isättiksyra gradvis tills önskat pH uppnås.

2. Montera perfusionspumpen

Montera perfusionspumpen och anslut alla glasdelar samt en perfusionsnål. Spola 100 ml kranvatten genom pumpens slangar för att avlägsna eventuella rester från glasdelarna. Ställ en bägare med fixativ i kylboxen.

3. Fyll systemet

Öppna änden på perfusionsslangen och placera den i bägaren med fixativ. Anpassa lösningsvolymen efter djurets storlek. Justera perfusionspumpens ventil till ett långsamt och jämnt droppflöde, och stäng sedan ventilen. Fyll perfusionsapparaten med 0,9-procentig (vikt/volym) koksaltlösning.

4. Förbered ingreppet

Lägg fram kirurginstrumenten bredvid operationsbordet. Ge djuret en injektion med narkosmedel anpassad efter dess kroppsvikt (ketamin 0,5 mg/kg). Placera djuret på operationsbordet med ryggen nedåt.

5. Exponera hjärtat

Gör ett snitt med skalpellen längs mellangärdet. Använd de stora saxarna med den trubbiga sidan nedåt och klipp loss bindväven vid mellangärdets undersida. Exponera hjärtat. Håll det slående hjärtat med pincetten och för in en nål i vänster kammare.

6. Starta perfusionen

Öppna perfusionspumpens ventil så att den 0,9-procentiga koksaltlösningen börjar flyta. Kontrollera att lösningen flödar fritt och att djuret lever – hjärtat ska slå kontinuerligt under hela processen. När blodet helt har ersatts av koksaltlösningen byter du över till den 4-procentiga paraformaldehydlösningen.

7. Avsluta och förvara

Stanna perfusionen och dissekera ut den vävnad som ska studeras. Förvara vävnaden i samma medium vid 4 °C tills vidare analys.