Safranin O-protokoll

Safranin O är ett kemiskt ämne som inom molekylärbiologin används som färgämne. Färgämnet binder till brosk – den vävnad som bygger upp öron, näsa och leder – samt till bakteriella endosporer, granuler som ingår i immunförsvarets respons och vissa proteiner såsom mukiner. De vanligaste Safranin O-protokollen omfattar broskfärgning, färgning av endosporer och analys av avkalcifierade kondyler.

Protokoll för broskfärgning

Denna metod används för att påvisa brosk, mukiner (tunga proteiner som bildas i hudvävnader) samt granuler från mastceller, vilka består av heparin och histamin. Broskprover fixeras med formalin och bäddas in i paraffin, enligt IHC World. Teknikern hydrerar proverna med vatten, färgar dem med Weigerts järnhematoxylin och sköljer därefter av överskottsfärgen. Nästa steg är färgning med fast green följt av sköljning i ättiksyra. Därefter tillsätts en 0,1-procentig lösning av Safranin O, som får verka i fem minuter innan proverna dehydratiseras i etylalkohol.

Vid mikroskopisk granskning framträder cellkärnorna i svart färg och cytoplasman i grågrön nyans. Brosk, mukin och mastcellgranuler syns tydligt som orange till röda strukturer.

Protokoll för färgning av endosporer

Endosporer är strukturer som bildas inne i vilande eller vegetativa bakterieceller och fungerar som en överlevnadsstrategi när organismerna utsätts för stress. Enligt American Society for Microbiology kan Safranin användas tillsammans med färgämnet malakitgrön vid studier av dessa vegetativa celler. I mikroskopet framstår endosporerna som gröna, medan de vegetativa cellerna visas i brunrött eller rosa.

Förfarandet börjar med att proverna vär fixationeras på objektglas. Därefter färgas de med malakitgrön under en värmekälla, sköljs noggrant med vatten och färgas slutligen med Safranin O löst i alkohol.

Protokoll för avkalcifierade kondyler

Detta protokoll tillämpas vid laboratoriestudier av avkalcifiering av leder, s.k. kondyler. Enligt Yuehuei An i boken "Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage" används Safranin O i vattenlösning för att färga både broskvävnad och områden med lågt kalciuminnehåll.

I praktiken färgar teknikern kaninkondylpreparat med Safranin O i 40 minuter, varpå de sköljs i tre omgångar destillerat vatten. Proverna doppar sedan i en alkoholisk lösning av fast green i 30 sekunder, följt av en snabb doppning i ättiksyra. Efter ytterligare sköljning i vatten dehydratiseras proverna med etanol. Innan mikroskopanalysen genomförs tillsätts lösningsmedlet xylen för att klargöra preparaten.