Vävnadsplasminogenaktivator (TPA) är en typ av serinproteas – alltså ett protein som kan bryta ner blodproppar. TPA förekommer i de celler som klär blodkärlens insida. TPA-protokoll utgör en del av den farmakologiska och medicinska forskningen kring stroke samt hjärt- och lungsjukdomar, exempelvis lungemboli och hjärtinfarkt.
Med TPA-rening avses isoleringen av detta protein från andra molekyler genom en serie processer, bland annat kromatografi och elektrofores. Nedan presenteras tre vanligt förekommande reningsprotokoll som används inom forskning och bioteknisk produktion.
Detta protokoll används i studier av fibrinolys, det vill säga processen där fibrinet – produkten av blodkoagulering – bryts ned, vilket har kopplats till tumörbildning. Tekniker extraherar TPA från acetontorkad svinnejure med hjälp av en kaliumacetatbuffert vid pH 4,2. Därefter tillsätts ammoniumsulfat för att inducera cellutfällning. Proverna blandas med n-butylsefaros och analyseras därefter i en kromatograf. Även konkanavalin A tillsätts, varefter kromatografi utförs för att separera de olika proteinerna från varandra.
Proteinrenhet är en avgörande faktor för framgången hos biologiska experiment. Renad TPA finns dessutom att köpa kommersiellt, vilket sparar tid och minskar risken att ett experiment äventyras på grund av en otillräckligt renad lösning. Detta protokoll omfattar reningsprocesser för TPA i såväl däggdjursceller som bakterieceller. Tekniker fäller ut cellproverna, filtrerar dem och genomför därefter affinitetskromatografi samt gelkromatografi. Resultaten analyseras och jämförs slutligen innan eventuell kommersiell produktion inleds.
Klarade celllysater appliceras på en lysin–sefaroskolonn, analyseras i en kromatograf och tvättas med en natriumkloridlösning. Ett annat prov lastas därefter på en andra kromatografikolonn som innehåller proteiner som binder till TPA med mycket hög affinitet. Ett prov från den andra kolonnen blandas slutligen med en zink–sefaroslösning. Det resulterande proteinet uppvisar en renhet på över 90 procent, enligt tidskriften Applied and Environmental Microbiology.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online