Gelelektrofores är en standardteknik inom molekylärbiologin som används för att separera DNA, RNA eller proteiner. Tekniken bygger på molekylernas elektriska laddning: när en elektrisk ström leds genom gelen vandrar de laddade molekylerna genom gelmatrisen och separeras efter storlek och form. Vilken metod som passar bäst avgörs främst av fragmentstorlek, önskad upplösning och hur DNA:t ska användas efter separationen.
Agarosgel är den vanligaste metoden för att visualisera DNA. Koncentrationen agaros anpassas efter storleken på de fragment som ska analyseras. En låg koncentration, exempelvis 0,7 procent, ger tillräcklig upplösning för att visualisera stora DNA-fragment, medan en högre koncentration, exempelvis 2 procent, används för mindre fragment. Typiskt separerar agarosgeler fragment från cirka 100 baspar upp till omkring 20 kilobaspar.
För att göra DNA:t synligt tillsätts ofta etidiumbromid, som interkalerar mellan basparen och fluorescerar under UV-ljus. Eftersom etidiumbromid är mutagent hanteras det med försiktighet, och säkrare alternativ som SYBR-färger används allt oftare.
Polyakrylamidgeler används för att separera mycket små DNA-fragment, från cirka 10 baspar upp till 1 kilobaspar. Separationsområdet är smalt, men upplösningen är hög – fragment som skiljer sig med endast ett enda baspar kan ibland skiljas åt. Gelen är dock mer komplicerad att framställa än agaros.
En fördel är att stora mängder DNA kan lastas utan att upplösningen försämras. Liksom vid agaroselektrofores används ofta etidiumbromid för visualisering, men polyakrylamid kan dämpa fluorescensen, vilket gör det svårare att se små mängder DNA. Metoden används bland annat vid sekvensering, SSCP-analyser och mikrosatellitstudier.
Denna form av elektrofores används för att separera mycket stora DNA-molekyler, till exempel kromosomstora fragment, och tillämpas ofta vid genotypning. Problemet är att stora fragment vandrar genom gelen med ungefär samma hastighet, vilket gör det svårt att skilja banden åt.
Lösningen är att växla riktning på det elektriska fältet. Genom att alternera fältet tvingas de långa molekylerna vända om och orientera sig om och om igen, vilket ger en betydligt bättre separation och upplösning. Metoden, ofta kallad PFGE, klarar fragment upp till flera megabaspar.
Kapillärelektrofores är en snabb och känslig metod för att separera DNA. Även mycket små mängder kan analyseras, och resultaten registreras automatiskt av en detektor. Visualiseringen sker antingen med fluorescerande märkning av DNA:t eller via UV-detektering. Metoden dominerar idag inom sekvensering, fragmentanalys och rättsmedicinsk DNA-typning eftersom den är automatiserbar och ger reproducerbara resultat.
DNA:s struktur kan komplicera separationen, eftersom sekundära strukturer påverkar hur fragmenten vandrar genom gelen. Genom att tillsätta ämnen som urea och formamid sänks DNA:s smältpunkt och strukturen denatureras, vilket gör att fragmenten separeras enbart efter längd. Tekniken kan användas i både agaros- och polyakrylamidgeler och är särskilt värdefull vid sekvensering och studier av mutationer.
Val av elektroforesmetod styrs i första hand av storleken på de DNA-fragment som ska separeras. Även syftet spelar roll: hur DNA:t ska användas efter separationen – till exempel isolering, sekvensering eller diagnostik – avgör vilken metod som lämpar sig bäst. Som tumregel gäller att agaros passar för rutinanalys av större fragment, polyakrylamid för högupplöst analys av små fragment, pulsfältsmetoder för mycket stora molekyler och kapillärelektrofores när snabbhet, känslighet och automatisering efterfrågas.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online