Nukleinsyrastest utförs inom medicinsk diagnostik för att påvisa patogener, exempelvis virus eller bakterier. Dessa tester är betydligt snabbare än traditionella metoder och gör det därför möjligt för läkaren att påbörja behandling av en patient som annars skulle ha behövt vänta på infektionsbekräftelse via långdragna och omständliga antikroppsbaserade analyser.
Processen kallas även nukleinsyraförstärkningstest och omfattar en metod som benämns revers transkriptas-förstärkning med polymeraskedjereaktion (RT-PCR). Eftersom detta är en högt specialiserad vetenskaplig procedur krävs avancerade kunskaper och praktisk erfarenhet inom molekylärbiologiska tekniker och teori.
Steg 1: Hösta cellerna med ett RNA-extraktionsreagens, till exempel Trizol. En milliliter räcker för att samla celler från en brunn i en sexbrunns vävnadskulturplatta. Pipettera cellerna noggrant upp och ner för att homogenisera dem och genomför därefter extraktionen enligt anvisningarna i Trizols datablad. Kortfattat innebär proceduren att provet extraheras med kloroform och därefter centrifugeras för att separera faserna av DNA, protein och RNA. Återvinn endast den färglösa RNA-fasen och fäll ut den med isopropanol. Efter inkubation centrifugeras provet igen och den resulterande pelleten renas med flera etanoltvättar. Lös slutligen upp pelleten i RNase-fritt vatten.
Steg 2: För revers transkription denaturerar du exakt 5 mikrogram RNA vid 65 grader Celsius i en volym av 10 mikroliter (µl) RNase-fritt vatten och placerar sedan provet snabbt på is. För varje reaktion kombineras 10 µl RNA, 3 µl 10X PCR-reaktionsbuffer, 2,5 µl 10 millimolärt dNTP, 6 µl 25 millimolärt magnesiumklorid, 1 µl slumpmässiga primers med koncentrationen 1,8 milligram per milliliter samt 0,5 µl SuperScript II-revers transkriptasenzym. Fyll på varje reaktion med 17 µl RNase-fritt vatten. Inkubera rören i rumstemperatur i tio minuter och därefter vid 42 grader Celsius i en timme för att bilda cDNA. Denaturera sedan provet vid 95 grader Celsius och kyl det snabbt på is för att stoppa reaktionen.
Steg 3: För själva polymeraskedjereaktionen ställer du återigen upp en reaktionsblandning i 0,5 ml-rör genom att kombinera 6 µl cDNA från revers transkriptionsreaktion, 1,5 µl 10X PCR-reaktionsbuffer, 0,2 mikroliter Taq-polymeras, 0,5 mikroliter reverse primer samt 0,5 mikroliter forward primer. Fyll därefter på varje rör med 10,3 µl RNase-fritt vatten. Kör reaktionerna genom att programmera termocyclern (en maskin som utför polymeraskedjereaktioner) för 30 cykler enligt följande: 95 grader Celsius i 30 sekunder för denaturering, följt av 60 grader Celsius i 45 sekunder för annealing, och slutligen 72 grader Celsius i en minut för förlängning av det syntetiserade transkriptet.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online