Immunohistokemi (IHC) är en specialiserad teknik som forskare använder för att visualisera celler i vävnadssnitt. Tekniken bygger på att vävnaden placeras på ett objektglas och färgas med en antikropp som känner igen ett protein som är specifikt för den celltyp eller vävnad som studeras. För att få tillförlitliga resultat måste antikroppen spädas ut i rätt koncentration. Spädningsserien (titreringen) ska alltid utföras under de experimentella förhållanden som anges i ditt eget laboratoriums protokoll – inte enligt tillverkarens rekommendationer, eftersom förutsättningarna ofta skiljer sig åt.
Börja med att verifiera att antikroppen är framställd i rätt värdart och att den reagerar med exakt den variant av proteinet (isoform eller splajsvariant) som ska undersökas. Använd därefter en pipett för att försiktigt överföra 10 mikroliter antikropp till ett eget rör, som märks ”personlig stam” (personal stock).
Om endast mycket små volymer av antikroppen finns tillgängliga kan detta steg hoppas över.
Att hålla en personlig stam av antikroppen är standardrutin på alla laboratorier, eftersom det minskar risken för korskontaminering av den ursprungliga stammen. Överför antikroppen till ett ljusskyddat mikrocentrifugrör, eller ett vanligt rör som lindas in i aluminiumfolie för att skydda mot direkt ljus.
Ställ röret på is, helst i en kylbox med tättslutande lock, för att även här minimera ljusexponeringen – ljus kan nämligen förstöra antikroppen. Anteckna på röret den ursprungliga stammens koncentration (t.ex. 100 enheter per milliliter eller 1 milligram per mikroliter), antikroppens namn samt vilken buffert den är utspädd i (t.ex. serum, saltlösning eller vatten).
Framställ spädningsbufferten, även kallad antikroppsspädningsmedel. Kontrollera att bufferten är kompatibel med både antikroppen och den immunohistokemiska metod som används – den får exempelvis inte dämpa fluorescens eller störa efterföljande märkning med sekundär antikropp.
En vanlig standardbuffert för immunohistokemi (som även fungerar som blockeringbuffert) framställs genom att blanda 1X fosfatbuffrerad saltlösning (PBS) med 1 % Triton X-100, 10 % fetalt kalvserum och 0,2 % natriumazid.
Utifrån den koncentration som anges för den personliga stammen (uttryckt i koncentrationsenheter som mikrogram per mikroliter) beräknar du den volym antikropp som behövs för att få 10 mikrogram antikropp.
Skapa därefter en spädningsserie genom att pipettera en volym motsvarande 2 mikrogram antikropp (X mikroliter) till 100 mikroliter spädningsmedel. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger. Ta sedan samma volym (X mikroliter) från denna första spädning och tillsätt till nya 100 mikroliter spädningsmedel. Upprepa proceduren tills du har 8–10 spädningar i serien.
Det första röret innehåller den högsta koncentrationen – den så kallade mättande koncentrationen, som ger den starkaste signalen i experimentet. Den idealiska arbetskoncentrationen ligger dock något under denna nivå, eftersom en alltför kraftig signal kan ge upphov till bakgrundsstörningar och missvisande resultat.
Märk slutligen alla rör tydligt med sina nya, utspädda koncentrationer.
Arbeta alltid kallt och skydda antikropparna från ljus genom hela processen. Dokumentera alla spädningar noggrant så att resultaten kan reproduceras, och spara den personliga stammen för framtida experiment.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online