Ligering är en metod som används inom biologisk forskning för att sammanfoga separata DNA-strängar. Processen har förenklats tack vare kommersiellt tillgängliga ligationskit. En ligering följs i allmänhet av transformation, en process där det sammanfogade DNA:t förs in i en bakteriell värdvektor för att klona och förstärka DNA:t. Eftersom metoden är komplex motsvarar resultaten ofta inte den önskade produkten, vilket gör felsökning nödvändig. Detta är särskilt vanligt när flera fragment ska sammanfogas, till exempel vid en trefragmentsligering.
Felsökning av ett vetenskapligt protokoll börjar oftast med det sista steget och arbetar baklänges. Börja därför med att formulera en lista över stegen som ingår i ligering och transformation.
Jämför det renade DNA-produktet från provet med kontroll-DNA:t som medföljer kittet. När DNA har transformerats och klonats i bakterier kan det isoleras, renas och kontrolleras med agarosgelelektrofores. Resultaten från elektroforesen visar om transformationen lyckades.
Bestäm bakterietillväxten under kloningen. De flesta bakteriella vektorer är konstruerade så att endast de celler som bär på ett DNA-insert kan växa på ett medium som innehåller ampicillin eller annat antibiotikum. Dålig tillväxt kan tyda på att DNA-provet inte framgångsrikt infogades i vektorn.
Kontrollera att det ligade DNA-provet renades innan transformationen. Buffertsalter och ligationsenzymer kan hämma transformationen av det insatta DNA:t. Det är också viktigt att säkerställa att ligationsenzymet inaktiverades genom värmebehandling efter avslutad ligering. Aktivt ligas kan potentiellt större transformationen.
Titta på datumet för den bakteriestam som användes för transformationen. Gamla bakterieceller förlorar effektivitet över tid. Så småningom blir cellerna oförmögna till transformation och kvalitativ kloning. När transformationsprocessen har diagnostiserats kan du börja analysera ligeringen.
Kontrollera renheten hos ditt DNA-prov före ligeringen. Saltföroreningar i DNA-provet kan leda till dålig ligering. Provet bör vara renat och fritt från salter och enzymer innan det används i ligeringen.
Bekräfta om ändarna på de DNA-strängar som ska ligeras är trubbiga eller klibbiga. Ligering används för att sammanlänka separata strängar med trubbiga ändar eller klibbiga ändar efter digestion med specifika restriktionsenzymer. T4-DNA-ligas är enzymet som föredras för trubbiga DNA-ändar, men det fungerar även för DNA med klibbiga ändar. Andra DNA-ligaser fungerar endast på DNA som behandlats med ett restriktionsdigest för att skapa klibbiga ändar. Det är viktigt att använda rätt ligas för det DNA som testas.
Kontrollera koncentrationen av DNA-proverna före ligeringen. Användning av DNA med hög koncentration gör ofta att DNA:t blir linjärt. Kittets bruksanvisning ger information om rätt mängd DNA som ska användas i ligationsreaktionen.
Ersätt ligasenzymet med en ny sats. Enzymer är särskilt känsliga för rumstemperatur och upprepade frysnings- och upptiningcykler. Ligaset kan skadas efter ett antal användningar, helt enkelt genom att frysas och tinats för många gånger. Vissa kit rekommenderar att ligaset aliquoteras i mindre portioner vid första användningen, för att minska antalet gånger det behöver frysas igen.
Granska ditt ligationskit. Ofta beror problemet med ligeringen på att ett kit har passerat sitt utgångsdatum eller blivit kontaminerat med annat DNA och salter.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online