T-celler tillhör familjen av immunceller som kallas lymfocyter och bildas under ett adaptivt immunsvar. De utgår från stamceller i benmärgen och mognar i thymus (brässen). Det finns flera olika typer av T-celler, som var och en har en specifik funktion. T-celler skiljs åt med hjälp av den antigenreceptor som sitter på cellytan. En delgrupp av T-cellerna bär CD4-markören och spelar en viktig roll för att inducera ett immunsvär.
T-celler kan erhållas från flera olika källor, exempelvis mjälten, lymfknutarna och thymus, men perifert blod är den lättillgängligaste källan när det gäller odling av T-celler. Blodprov screenas noggrant för infektioner och andra föroreningar och hanteras varsamt i ett säkerhetsbänk. T-celler odlas av flera olika skäl, bland annat för att mäta toxicitet och för att studera immunologiska svar efter vaccination.
T-celler separeras vanligtvis från helblodsprov med hjälp av densitetsgradientseparation. Eftersom T-celler är mindre täta än röda blodkroppar, såsom erytrocyter, kan de extraheras genom centrifugering. Först tillsätts en lämplig neutral saltlösning till blodprovet, följt av en Ficoll-Isopaque-lösning. Ficoll-Isopaque har en högre densitet än T-celler men lägre än erytrocyter och bildar under centrifugeringen ett mellanskikt mellan de båda celltyperna, vilket gör att T-cellerna kan avlägsnas från toppen.
Därefter centrifugeras T-cellerna igen, supernatanten avlägsnas och en liten aliquot räknas för att fastställa cellernas viabilitet. Cellerna används antingen direkt i experiment eller kryokonserveras för framtida bruk.
Kryokonserveringsreagens bör förberedas i förväg för att undvika att T-cellerna bryts ner i rumstemperatur. Om detta inte är möjligt ska cellerna förvaras på is eller i kylskåp. Reagenset består av cellkulturmedium med 10–13 procent humant serumalbumin (HSA), samt cellkulturmedium med 10 procent dimetylsulfoxid (DMSO). DMSO minimerar uttorkning, pH-förändringar och förändringar i elektrolytkoncentrationen i samband med frysning.
T-cellerna suspenderas om i reagenset som innehåller cellkulturmedium och HSA i ett kryorör. Därefter tillsätts DMSO-reagenset långsamt till cellerna under försiktig omrörning. Cellerna överförs sedan till en frysenhet som innehåller isopropanol, vilket säkerställer en gradvis temperatursänkning, innan de förvaras.
När T-cellerna ska tinas tas ett kryorör ur förvaringen och placeras i inkubator vid 37 grader Celsius. Därefter tillsätts lämpligt tinningsmedium långsamt till cellerna tills volymen har fördubblats, varefter suspensionen överförs till ett separat rör och centrifugeras. Benzonas tillsätts ibland till tinningsmediet för att förhindra att döda T-celler klumpar ihop sig. Den centrifugerade pelleten resuspenderas i cellkulturmedium och cellviabiliteten bedöms. T-cellerna är sedan redo att användas i aktuella experiment.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online