T - Cell Culture protokoll

T- celler , som tillhör en familj av immunceller som kallas lymfocyter , genereras under ett adaptivt immunsvar . T- celler som härrör från benmärg och mognar i tymus . Det finns flera olika typer av T-celler, var och en med en annan funktion. T-celler kan särskiljas från varandra genom det bifogade T-cellantigenreceptor. En undergrupp av T-celler som bär CD4- markören och hjälper till att inducera ett immunsvar . Källor till T-celler

T-celler kan erhållas från olika källor, inklusive mjälte, lymfkörtlar och tymus, men perifert blod är den mest lättillgängliga källan för T-celler för odlingsändamål . Blodproversökts för infektioner och andra föroreningar och hanteras försiktigt under ett säkerhetsskåp . T- celler odlas av flera skäl , bland annat toxicitetsmätningar och att studera immunologiska vaccinsvar.
Isolering

T-celler vanligen separeras från helblod av densitet - gradient separation, såsom T-celler är mindre tät än röda blodkroppar , såsom erytrocyter och därför utvinns genom centrifugering. En lämplig neutral saltlösningensättes till blodprovet , följt av en FicoU Isopaque lösning. Ficoll- Isopaque har en densitet som är större än T-celler , men mindre än erytrocyter och under centrifugering bildar ett mittskikt mellan de båda cellerna , vilket gör att T-celler kan avlägsnas från toppen. De T-celler är ytterligare centrifugeras, supernatanten avlägsnas , och en liten alikvot räknas för att bestämma cellviabilitet . Cellerna används antingen direkt för experiment eller frysförvarade för framtida bruk .
Frysförvaring

Frysförvaring reagenser förbereds i förväg för att undvika nedbrytning T - cell på rummet temperatur. Om det inte är möjligt , är celler som förvaras på is eller i kylskåp . Reagens bestå av cellodlingsmedia och från 10 till 13 procent av humant serumalbumin (HSA )-protein , såväl som cellodlingsmedia och 10 procent dimetylsulfoxid (DMSO). DMSO minimerar uttorkning , förändringar pH och förändringar elektrolytkoncentration samband med frysning . T- celler återsuspenderas i reagensinnehållandecellodlingsmedia och HSA i ett cryotube . Reagenset innehållande DMSO tillsattes långsamt till cellerna och roterades försiktigt . Cellerna överföres därefter till en fryskärlet innehållande isopropanol för att säkerställa en gradvis minskning av temperaturen och lagras. Addera Upptining

När T-celler har tinats , en cryotube avlägsnas från lagret och inkuberades vid 37 grader Celsius. Därefter tillsätts det lämpliga upptining mediet långsamt till cellerna tills två gånger volymen uppnåtts , överfördes till ett separat rör och centrifugerades . Benzonase ibland tillsatt i upptining mediet för att förhindra hopklumpning av döda T-celler. Den centrifugerades pelleten reagerade i cellodlingsmedia och cellviabiliteten utvärderas . T-cellerna är sedan klar att använda för respektive experiment . Addera