Princip
Kaseinhydrolys → ↓ dimma (avljusning) + ↑ lösliga peptider/aminosyror. Absorbans vid 280 nm (aromatiska AS) eller 440 nm (färgmetod med TCA/Folin) ökar när peptider ackumuleras. Mer objektiv än visuell avljusning.
Optimerat protokoll
Material
- Trypsinlösning (t.ex. 0,1 mg/mL i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM CaCl₂)
- Kaseinsubstrat (1% w/v i samma buffert; eller azokasein för färgmetod)
- Stoplösning: 10% TCA eller 0,5 M NaOH (denaturerar trypsin)
- Spektrofotometer + kvartskvetter (1 cm väglängd)
- Vattenbad (37°C)
Procedur
- Förvärm substrat & enzym separat (37°C, 5 min).
- Initiera reaktion: Blanda 1 mL kasein + 0,1 mL trypsin (slutlig [E] definierad). Starta timer.
- Vid intervaller (0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 min), ta 0,2 mL aliquot → 0,8 mL stopplösning. Vortexa.
- Centrifugera 10 000g × 5 min (avlägsna fällat protein).
- Mät överstånd A₂₈₀ (peptidbindningar) eller kör Folin-Lowry/BCA på överstånd för total peptidkvantifiering.
- Rita A₂₈₀ (eller µg peptid/mL) mot tid.
Slutpunktsbestämning
- Initialhastighetsmetod (rekommenderad): Linjär regression av tidiga tidpunkter (0–10% hydrolys) → V₀ (ΔA/min). Undviker slutpunktsoklarhet.
- Plateaumetod: Tidpunkt då ΔA/Δt <5% av initial hastighet (reaktion nära avslut).
- Fast-tidsanalys: Jämför A vid definierad tid (t.ex. 10 min) mot standardkurva (kaseinhydrolysat).
Fördelar över visuell avljusning
- Kvantitativ, reproducerbar, kinetiska data (Kₘ, Vₘₐₓ möjliga).
- Okänslig för observatörsbias, belysning, partikelstorlek.
- Upptäcker tidig hydrolys innan synlig avljusning.
Vanliga fallgropar
- Kaseinpartivariabilitet → kör standardkurva varje analys.
- TCA-fällning ofullständig → spridning vid 280 nm. Använd 0,22 µm filter.
- Trypsin autolys vid 37°C → inkludera enzymering blankprov.
