Tetrametylrhodamin etyl (TMRE) är ett långsamt, lipofilt och katjoniskt fluorescerande omfördelningsfärgämne som används i MitoPT™ TMRE/TMRM-kit för bedömning av mitokondriell membranpotential, tillverkat av ImmunoChemistry Technologies, LLC. Metoden gör det möjligt att visualisera den transmembrana elektriska potentialgradienten i celler.
I friska celler ackumuleras TMRE i mitokondrierna tack vare deras negativa membranpotential, vilket ger ett starkt fluorescenssignal. När mitokondrierna depolariseras – exempelvis i samband med apoptos – minskar färgämnesackumuleringen och därmed även fluorescensen. Resultaten kan analyseras med flödescytometri eller fluorescensmikroskopi.
Protokollet är enkelt att följa och själva processen tar cirka 20 minuter vid 37 grader Celsius. De levande celler som används i analysen kan dock kräva allt från några timmar till flera dagars förberedelse innan de är redo att användas. Kontrollcellerna kan också ta flera timmar att förbereda, eftersom de behöver induceras att genomgå apoptos.
Odla celler till en densitet som är optimal för induktion av apoptos eller oxidativ stress, enligt din specifika induktionsmetod, men överskrid inte 106 celler/ml.
Odla samtidigt en icke-inducerad negativ kontrollpopulation av celler, med samma densitet som den inducerade populationen.
Inducera apoptos eller depolarisera medvetet mitokondrierna enligt det protokoll du valt.
Förbered 1X-analys-/tvättbuffert.
Förbered en stammlösning av MitoPT™ TMRE/TMRM med koncentrationen 1 mM eller 0,2 mM. För protokollets del 6 framställs en utspädning på 1:100 av 1 mM-lösningen, alternativt 1:20 av 0,2 mM-lösningen, som ska tillsättas i cellkulturproverna.
För protokollets del 7 färgas cellerna med en slutkoncentration på 20–200 nM av MitoPT™ TMRE/TMRM-lösningen.
För protokollets del 8 analyseras data. Jämför fluorescenssignalen från de inducerade cellerna med den icke-inducerade kontrollen för att fastställa graden av mitokondriell depolarisering.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online