Proteiner interagerar ständigt med varandra i cellen och bildar komplex som styr nästan alla biologiska processer – från signalsubstanser och ämnesomsättning till celldelning och immunförsvar. För att förstå dessa processer på molekylär nivå krävs tillförlitliga metoder för att studera protein-protein-interaktioner. Här presenteras de vanligaste och mest använda teknikerna inom området.
Ko-immunoprecipitation är en av de mest använda teknikerna för att studera proteininteraktioner i sin naturliga cellulära miljö. Metoden bygger på att ett så kallat betesprotein (bait protein) fångas ur en celllysat med hjälp av en antikropp som är specifik för just det proteinet. Om andra proteiner (byten, prey proteins) är bundna till betesproteinet följer de med i komplexet.
Efter immunoprecipitationen kan de interagerande proteinerna identifieras och analyseras med olika nedströmsmetoder, exempelvis Western blotting, masspektrometri eller immunofluorescensfärgning. Fördelen med Co-IP är att interaktionerna studeras under fysiologiska förhållanden, men metoden kräver godtagbara antikroppar och kan missa svaga eller transienta interaktioner.
Pull-down-analyser baseras på principen om affinitetskromatografi. Ett betesprotein immobiliseras på ett fast material, till exempel magnetiska pärlor eller agarosharts, antingen genom kovalent bindning eller genom fusion med en tagg som GST eller His-tagg. Celllysaten eller en renad proteinblandning inkuberas därefter med det immobiliserade betesproteinet.
Efter tvättning för att avlägsna obundna proteiner elueras de interagerande proteinerna och analyseras, ofta med masspektrometri. Metoden är särskilt användbar för att bekräfta direkta interaktioner mellan renade proteiner och för att kartlägga vilka proteiner i en blandning som binder till ett givet målprotein.
FRET är en teknik som mäter energiöverföring mellan två närbelägna fluoroforer – en donator och en acceptor. När fluoroforerna befinner sig inom ett avstånd av cirka 10–100 ångström exciteras donatorfluoroforen, vilket leder till att acceptorn emitterar ljus. Denna energiöverföring kan kvantifieras och användas för att övervaka protein-protein-interaktioner i realtid, även i levande celler.
FRET kan implementeras på flera sätt, bland annat genom att märka proteiner med specifika fluoroforer eller genom att använda genetiskt kodade fluorescerande proteiner som GFP och RFP. Tekniken är särskilt värdefull för att studera dynamiska interaktioner och konformationsförändringar över tid.
Biomolekylär interaktionsanalys, ofta kallad ytplasmonresonans (SPR), är en etikettfri teknik som mäter förändringar i brytningsindex vid gränssnittet mellan ett glasunderlag och ett strömmande medium. Ett av de interagerande proteinerna immobiliseras på glasytan, varefter det andra proteinet passerar över ytan i en kontinuerlig ström.
När proteinerna binder till varandra förändras brytningsindex, vilket detekteras och kvantifieras i realtid. SPR ger detaljerad information om bindingsaffinitet samt kinetiska parametrar som associations- och dissociationshastigheter, vilket gör tekniken oumbärlig vid karakterisering av interaktioners styrka och hastighet.
ITC mäter den värme som avgivs eller absorberas när två molekyler interagerar. Vid proteinbindning frigörs värme (exoterm reaktion) eller tas upp (endoterm reaktion), och denna värmeförändring registreras med hög precision.
Tekniken möjliggör bestämning av bindingsaffiniteten (Kd) samt termodynamiska parametrar som entalpiändring (ΔH) och entropiändring (ΔS). Eftersom inga märkningar eller immobiliseringar krävs kan ITC studera interaktioner i lösning under naturliga förhållanden, vilket ger en komplett termodynamisk profil av interaktionen.
Proteininteraktionsarrayer möjliggör högt genomflöde-screening av protein-protein-interaktioner i mikroarrayformat. Tusentals olika proteiner eller peptider immobiliseras på en solid yta, och bindningen av ett specifikt intressant protein detekteras med märkta antikroppar eller andra detektionsmetoder.
Denna teknik erbjuder snabb och storskalig analys av tusentals potentiella interaktioner samtidigt, vilket gör den idealisk för upptäcktsfasen där nya interaktionspartners ska identifieras innan mer detaljerade studier genomförs.
Jästtvåhybridanalysen är en genetisk metod som används för att identifiera protein-protein-interaktioner i jästceller. Kodningssekvenserna för två proteiner fusioneras till två olika domäner av en transkriptionsfaktor. Om proteinerna interagerar rekonstitueras transkriptionsfaktorn, vilket leder till uttryck av en reportergen.
Positiva interaktioner identifieras baserat på jästcellernas tillväxt på selektiva medier eller genom kolorimetriska analyser. Metoden är särskilt kraftfull för storskalig screening av bibliotek och har bidragit till kartläggningen av tusentals interaktioner i olika organismsystem.
Valet av metod beror på flera faktorer: de specifika proteinerna som studeras, tillgången på reagens och utrustning samt vilken typ av information som eftersträvas. För att bekräfta interaktioner i celler passar Co-IP väl, medan SPR och ITC lämpar sig för exakta kinetiska och termodynamiska mätningar. FRET är idealisk för realtidsstudier i levande celler, och Y2H eller proteinarrayer används bäst för bred screening.
I praktiken kombinerar forskare ofta flera tekniker för att få en heltäckande bild av protein-protein-interaktioner – från initial upptäckt till detaljerad karakterisering av affinitet, kinetik och biologisk relevans.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online