Kryopreserveringsprocedurer gör det möjligt att lagra celler på obestämd tid genom att använda extremt låga temperaturer som sätter cellens metabola aktiviteter i vila. Det finns två huvudtyper av kryopreserveringsmetoder: ekvilibrium (konventionell långsam frysning) och icke-ekvilibrium, även kallat ultrarapid frysning (vitrifikation). Termen vitrifikation kommer från latinets ord för "glasartad". Båda metoderna använder kryoprotektiver med frostskyddsegenskaper för att förhindra att cellerna skadas under frysningsprocessen. När cellerna har frysts eller vitrifierats kan de lagras på obestämd tid genom att nedsänkas i flytande kväve, en extremt kall vätska med temperaturen –196 °C (–321 °F). För att återställa cellens metabola aktivitet vid upptining måste de giftiga kryoprotektiverna avlägsnas från cellen, och den normala vattenbalansen måste gradvis återställas när cellen förs tillbaka till sin normala funktionstemperatur.
Vilken metod som används för att kryopreservera celler eller vävnad beror på flera faktorer, bland annat cellens storlek, mängden cellulär vätska (cytoplasma) och cellens komplexitet (encellig cell eller vävnad). Celler med mycket cytoplasma, som äggceller, är svårare att kryopreservera än celler med endast resterande cytoplasma, som spermier. Kryopreservring av äggstocksvävnad är extra utmanande eftersom minst tre olika celltyper av varierande storlek finns i vävnaden, var och en med olika optimala frysningsbehov. Protokoll för långsam frysning har använts med framgång för många olika celltyper. Vitrifikation är för närvarande mest effektiv vid frysning av enskilda celler och mindre effektiv för hela vävnader, men forskning pågår för att optimera vitrifikation av vävnader.
En cells cytoplasma innehåller vatten, som bildar iskristaller vid frystemperatur. När is bildas inuti en cell krossas den och dör. Därför måste vätskan i cellen avlägsnas innan frystemperaturen nås för att undvika cellskador. Olika typer av frostskyddsmedel (kryoprotektiver) kan användas för att dehydrera cellen före frysning, bland annat glycerol, propandiol, dimetylsulfoxid (DMSO), etanol samt sockerarter som sackaros och trehalos. Den optimala kylhastigheten (och upptiningshastigheten) beror på vilken typ av kryoprotektiv som används samt på egenskaperna hos den cell eller vävnad som ska (eller har) frysts. Kryoprotektiver är giftiga för metaboliserande celler, vilket innebär att cellernas exponering för kryoprotektiver vid varmare, metabola temperaturer måste minimeras eller helt undvikas. Vid upptining eller uppvärmning av cellerna måste kryoprotektiverna ha avlägsnats helt innan den metabola aktiviteten återupptas.
Fryshastigheten avgörs av om frysningsprotokollet bygger på ekvilibrium eller icke-ekvilibrium. Vid ekvilibriumsmetoder uppnås den optimala fryshastigheten när det råder balans mellan hastigheten med vilken cellen dehydreras och hastigheten med vilken vattnet utanför cellen omvandlas till is. Dessa ekvilibrium- eller långsamma frysningsprotokoll tar vanligtvis flera timmar att genomföra, och en dator styr en programmerbar frysenhet så att fryshastigheterna blir exakt som krävs. I protokollet ingår oftast ett "paussteg" i början för att möjliggöra manuell skapelse av startiskristaller, så kallad "sådd", i vätskan utanför cellerna.
Vid vitrifikation används en helt annan frysningsmetod som inte förlitar sig på temperaturomgångar eller på att uppnå jämvikt mellan dehydrering och iskristallbildning. Vitrifikationen är så ultrarapid att det inte hinner bildas någon is, och den cellulära vätskan omvandlas direkt till ett glasartat tillstånd utan att skada cellen. Programmerbara frysenheter behövs inte, eftersom cellen direkt doppas i extremt kallt flytande kväve, vilket ger ett omedelbart glasartat tillstånd.
Det första steget i den långsamma frysningsproceduren är att gradvis och stegvis utsätta cellen för kryoprotektivet, så att cellen långsamt kommer i jämvikt med ämnet samtidigt som vatten frigörs. När cellerna har befriats från större delen av sitt cellulära vatten placeras de, tillsammans med kryoprotektivvätskan, i någon form av behållare, till exempel ett plaststrå, en glasampull eller en plastflaska. Vätskevolymen som omger cellerna vid långsam frysning är vanligtvis mindre än en tesked och kan ibland vara bara några droppar. Den förhandsmärkta behållaren fylls, försluts och placeras i en programmerbar frysare, som långsamt sänker temperaturen under några minuter eller timmar till mycket låga nivåer. Efter några minuters kylning måste startiskristaller bildas inuti behållaren genom "sådd". Sådden utförs med ett verktyg (till exempel pincett) som förkyldts i flytande kväve, som förs mot behållaren för att utlösa iskristallbildning. Startkristallen initierar en kontrollerad isbildning på en plats säkert avlägsen från cellerna. När sådden är klar fortsätter resten av kylningsprocessen. När behållaren når en temperatur mellan –30 och –85 °C kan den doppas direkt i flytande kväve för att fullborda kylningen till –196 °C.
Ultrasnabba icke-ekvilibriumskylningsprocedurer som vitrifikation använder högre koncentrationer av kryoprotektiver i kombination med en nästan omedelbar fryshastighet, som uppnås genom att cellerna doppas direkt i flytande kväve. Vitrifikation hoppar över fasen med iskristallbildning och överför vattnet direkt till ett glasliknande tillstånd. Metoden uppnår samma slutresultat som långsam frysning, men med en hastighet på cirka –3 000 °C per minut, jämfört med 10 °C per minut eller mer. Vid vitrifikation placeras cellerna vanligtvis på spetsen av ett strå, och överskottet av kryoprotektiv avlägsnas så att endast tillräckligt mycket återstår för att cellen ska fastna vid behållaren genom ytspänning, innan den doppas i flytande kväve. Eftersom frysningen går så snabbt blir exponeringstiden för kryoprotektiverna mycket kortare, och cellen tål då betydligt högre koncentrationer. Uppvärmningen av cellen för att återställa dess normala metabola funktion måste också ske otroligt snabbt. Hanteringen av vitrifierade prover är betydligt mer krävande än för långsamt frysta prover, eftersom även en kort exponering för en temperatur över flytande kvävets kan starta en oplanerad uppvärmning och efterföljande återfrysning, vilket skadar cellen.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online