Så förökar du rekombinanta plasmider: metoder och steg-för-steg-guide

Plasmider är relativt små, självreplikerande ringar av DNA som finns hos vissa bakterie- och jästarter, placerade utanför cellens huvudkromosom. De är oerhört användbara inom gentekniken eftersom det är relativt enkelt att skära in utvalda gener från andra arter i plasmider, överföra dem mellan värdceller från samma eller olika arter samt stimulera dem att replikera sig i betydligt högre takt än normalt – så kallad amplifikation.

Rekombinanta plasmider är helt enkelt de plasmider som konstruerats för att innehålla gener från andra arter. I synnerhet vid amplifierad förökning kan rekombinanta plasmider snabbare och mer effektivt uttrycka önskade proteiner i stor skala, exempelvis för industriell produktion.

Det här behöver du

• Färdiga plasmid- och genbanker, eller plasmider och gener som du själv isolerat från sina värdorganismer och sammanfogat
• Utrustning för cellodling
• Amplifieringsmedel som kalciumklorid, elektriska stötar, köld- och värmechocker, kloramfenikol och/eller enzymet Taq-polymeras

Instruktioner

1. Välj lämplig metod

Välj den eller de amplifieringsmetoder som bäst passar din specifika rekombinanta plasmid och värdorganism. Vissa metoder fungerar bättre med vissa plasmider och värdar än med andra. Om du arbetar med en ny, fortfarande experimentell rekombinant plasmid och/eller testar en annan värdart kan du behöva identifiera den bästa proceduren genom försök och misstag.

2. Prova transformering

Om just din plasmid och din värdcellstyp kan antas reagera på denna metod är transformering värd att testa. Kyl ner cellerna och plasmiderna till noll grader Celsius i en kalciumkloridlösning (CaCl₂). Höj sedan snabbt temperaturen till 37–43 °C. Den abrupta temperaturförändringen gör att cellmembranen tar upp större mängder av plasmiden.

3. Använd elektroporering

Skicka högspänningspulser genom lösningen av plasmider och celler om elektroporering är önskad metod. Tekniken ökar cellmembranens permeabilitet, vilket gör det möjligt för plasmiderna att tränga in i cellerna.

4. Tillsätt kloramfenikol

Utsätt värdcellkulturen för låga halter av antibiotikan kloramfenikol för att generera upp till hundra plasmider per cell. Metoden hämmar replikationen av värdcellernas huvudkromosomer samtidigt som den inducerar okontrollerad replikation av plasmiden, inklusive den inskjutna genen.

5. Använd PCR

Använd polymeraskedjereaktionen (PCR) för att generera plasmidkopior i mycket stora kvantiteter. PCR bygger på DNA-polymerisering, den kemiska reaktion genom vilken genetiska sekvenser bildas i naturen. Reaktionen katalyseras oftast av ett värmebeständigt enzym som kallas Taq-polymeras, vilket ursprungligen extraheras från en bakterieart som lever i varma källor.