Protokoll för QuikChange-mutagenes – så fungerar metoden steg för steg

Vad är QuikChange-mutagenes?

QuikChange-mutagenes är varumärket för en reagenssats som används inom bioteknisk forskning för att framkalla genetiska mutationer eller andra förändringar i DNA. Företaget bakom produkten är Agilent Technologies, och satsen finns i två versioner: QuikChange II och QuikChange Lightning. Båda satserna innehåller en buffertlösning, enzymet DNA-polymeras, färgreagenser, DNA-sekvenser eller primers samt cellprover.

Arbetet med QuikChange-mutagenes följer tre huvudprotokoll: syntes av mutantsträng, nedbrytning med restriktionsenzymet Dpn I samt transformation av XL1-Blue-cellerna. Nedan går vi igenom respektive steg i detalj.

1. Reaktionsprotokoll för syntes av mutantsträng

Tekniker syntetiserar först två oligonukleotider, det vill säga korta DNA-sekvenser som bär på den önskade mutationen. Därefter förbereds kontrollreaktionen med DNA-sekvenserna, en dNTP-blandning och DNA-polymerasenzymet, varefter destillerat vatten tillsätts.

Sedan tar teknikerna fram en serie provreaktioner med olika koncentrationer av dubbelsträngat DNA (dsDNA), samtidigt som koncentrationen av primer respektive oligonukleotider hålls konstant – allt enligt tillverkarens anvisningar. Proverna hålls vid 95 °C (203 °F) i 30 sekunder. Provet som innehåller DNA-segment nummer två testas även genom temperaturcykling, en teknik där temperaturen växlar under korta perioder. Avslutningsvis placeras proverna på is i två minuter.

2. Protokoll för Dpn I-nedbrytning av amplifieringsprodukter

Dpn I är ett restriktionsenzym som klyver DNA på specifika platser. En mikroliter av enzymet tillsätts direkt till varje amplifieringsreaktion, under det standardiserade skiktet av mineralolja, med hjälp av en mikropipett eller en speciell aerosoltät pipettspets. Observera att mineraloljeskiktet endast krävs om termocyklern – den apparat som används för att amplifiera DNA-segment – saknar så kallad hot-top-funktion.

Reaktionen blandas varsamt och centrifugeras därefter i en mikrocentrifug i en minut. Proverna inkuberas sedan vid 37 °C (98,6 °F) i en timme.

3. Protokoll för transformation av XL1-Blue superkompetenta celler

XL1-Blue är en tetracyklinresistent cellinje som medföljer QuikChange Mutagenesis-satserna. I detta protokoll töar teknikerna upp cellerna, som tidigare förvarats vid -80 °C (-112 °F), på is. Därefter tillsätts en mikroliter av det Dpn I-behandlade DNA:t, som värms till 42 °C (107,6 °F) i 45 sekunder innan reaktionen åter placeras på is i två minuter.

Efter detta tillsätts en beredning av NZY-medium (caseinhydrolysat och jästextrakt) som förvärmts till 42 °C, och blandningen inkuberas i en timme. Beredningen sprids därefter på agargelplattor och inkuberas vid 37 °C (98,6 °F) i 16 timmar.