QuikChange Mutagenes Protokoll

QuikChange mutagenes är varumärket av ett kit som används i bioteknisk forskning att framkalla genetisk mutation eller DNA- förändring . Agilent Technologies är företaget bakom produkten , som finns i två versioner, QuikChange II och QuikChange Lightning. Båda satser innehåller en buffertlösning , enzymet DNA-polymeras, färgreagens, DNA-sekvenser eller primrar och cellprover . Mutant Strand Synthesis Reaction Protocol

Tekniker syntetisera två oligonukleotider eller korta DNA-sekvenser innehållande den önskade mutationen. Sedan förbereder styr reaktion med DNA-sekvenser , dNTP mix lösning och DNA-polymerasenzym, tillsätta destillerat vatten . Senare förbereda de en serie av provreaktioner med användning av olika koncentrationer av dubbelsträngat DNA ( dsDNA ) , samtidigt som primer eller oligonukleotider koncentrationen konstant , enligt tillverkarens instruktioner. De hålla proverna vid 203 ° F under 30 sekunder. Provet innehåller DNA-segment nummer två är också testad under temperaturcykling , en teknik där temperaturförändringar under korta perioder av gånger . Slutligen är de prover placerades på is i två minuter. Addera Dpnl Digestion av amplifieringsprodukterna protokoll

Dpnl restriktionsenzym klipper DNA vid specifika ställen . En mikro - liter av detta enzym tillsätts direkt till varje amplifieringsreaktion under sin standard mineraloljetäckning med hjälp av en mikro - pipett eller specialiserad aerosol - resistent pipettspetsen . Emellertid är en mineraloljetäckning endast om värmecykeln , en apparat som används för att amplifiera DNA-segment , inte har en sjunkbox montering. Reaktionen är blandades försiktigt och senare placeras i en mikrocentrifug under en minut. Efter att proverna inkuberas vid 98,6 grader C i en timme . Addera Omvandling av XL1 -Blue Supercompetent Cells protokoll

XL1 - Blue är en tetracyklin resistent cellinje som kommer med de QuikChange Mutagenes kit . Under detta protokoll , tekniker tina cellerna , som tidigare hölls vid -112 grader F , på is . Sedan lägger en mikro - liter av Dpnl - behandlad DNA , värm till 107,6 grader F i 45 sekunder och placera reaktionen på is i två minuter . Efter denna procedur , tekniker lägga till en beredning av NZY ( kasein hydrolysat och jästextrakt ) förvärms till 107,6 grader F och inkubera under en timme . Preparatet är sedan lägga på agar- gel plattorna och inkuberas vid 98,6 grader F under 16 timmar . Addera