Så skapar du en restriktionskarta steg för steg
Under molekylärbiologins tidiga år var restriktionskartering en standardmetod för att förstå de gener som forskarna studerade. På moderna laboratorier har tekniken till stor del ersatts av DNA-sekvensering, som idag är både mer tillgänglig och betydligt billigare än förr. Det finns dock fortfarande situationer där en restriktionskarta är helt tillräcklig för att besvara en forskares frågeställningar.
Grundprincipen är enkel: restriktionsenzymer används för att klyva ett DNA-prov på specifika ställen. Genom att mäta storleken på de fragment som bildas kan du sedan ”återsätta” bitarna som ett pussel och härleda var enzymerna klippte – och på så sätt kartlägga DNA-molekylens struktur.
Du behöver
- Restriktionsenzymer
- DNA-prov
- Buffertlösning
- Is och varmvattenbad
- Utrustning för gelelektrofores
Instruktioner
Del 1: Spjälka DNA:t
- Tillsätt ett restriktionsenzym till ditt DNA-prov. Använd exempelvis EcoRI, ett av de mest använda enzymerna inom molekylärbiologin.
- Lägg blandningen i en buffertlösning. Bufferten utgör reaktionens miljö och håller rätt pH-värde och saltkoncentration så att enzymet fungerar optimalt.
- Höj temperaturen enligt rekommendationerna i New England BioLabs manual. Varje restriktionsenzym har en specifik temperatur där det presterar bäst – för EcoRI är det oftast 37 °C i ungefär en timme. Varje enzym riktar sig dessutom mot en bestämd nukleotidsekvens: EcoRI söker upp och klyver DNA vid sekvensen GAATTC. Denna exakta ordning måste finnas för att enzymet ska kunna binda och klippa strängen. Håll därför alla material på is fram till detta moment för att undvika oönskad aktivitet.
- Kör provet i en apparat för gelelektrofores. Där separeras DNA-fragmenten efter storlek; de minsta fragmenten vandrar längst genom gelen.
- Mät hur långt varje fragment har vandrat. Upprepa sedan hela proceduren separat med flera olika enzymer för att samla tillräckligt med data.
Del 2: Bygg upp restriktionskartan
- Sammanställ all data från gelerna. Samla den information du fått fram med hjälp av de olika restriktionsenzymerna.
- Härled ordningen på restriktionsställena. Jämför fragmentlängderna som respektive enzym producerat. Om enzym 1 exempelvis gav två lika långa fragment och enzym 2 gav tre lika långa fragment, kan du dra slutsatsen att enzym 1 klipper mitt på DNA-strängen och att enzym 2 delar den i tredjedelar.
- Montera ihop restriktionskartan. Utifrån slutsatserna i föregående steg fastställer du i vilken ordning restriktionsställena ligger längs DNA-molekylen.
